A20/TNFAIP3 (J7N7) Antibody [J7N7]

目錄號: F3346

抗體應用：反應性：Human, Mouse

Lane 1: A549, Lane 2: A549 (KO TNFAIP3), Lane 3: HeLa, Lane 4: HeLa (KO TNFAIP3)

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點

WB
建議曝光 60s 以上。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000-1:5000 IHC1:50 - 1:100

抗體應用
WB, IHC

反應性
Human, Mouse

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預測分子量
89 kDa

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。(建議曝光時長 60s 以上)。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。(建議曝光時長 60s 以上)。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
A20/TNFAIP3 (J7N7) Antibody [J7N7] 用于檢測內(nèi)源性 TNFAIP3 總的蛋白水平。

蛋白定位
細胞質(zhì)，溶酶體，細胞核

克隆號
J7N7

別名
A20/TNFAIP3,TNFAIP3

背景
TNFAIP3（A20）是一種重要的泛素編輯酶，由TNFAIP3基因編碼，是炎癥和免疫反應的關(guān)鍵負向調(diào)節(jié)因子。它在TNF-α、IL-1β和LPS等促炎刺激下迅速誘導，并主要作用于終止NF-κB信號傳導。TNFAIP3包含一個N端卵巢腫瘤（OTU）結(jié)構(gòu)域，具有去泛素化（DUB）活性，以及C端的多個鋅指（ZnF）結(jié)構(gòu)域，使其具有E3泛素連接酶和泛素結(jié)合能力。其雙重功能使得TNFAIP3能夠去除信號中介物如RIP1和TRAF6上的K63-連接泛素鏈，并添加K48-連接鏈，促使其被泛素酶體降解。通過編輯這些泛素鏈，TNFAIP3抑制NF-κB和MAPK通路的持續(xù)激活，從而防止過度的炎癥反應。TNFAIP3還表現(xiàn)出抗凋亡特性，特別是在胰腺β細胞和血管內(nèi)皮細胞中，幫助細胞在炎癥壓力下存活。TNFAIP3的功能缺失突變或其表達降低與自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和各種癌癥（尤其是B細胞淋巴瘤）的易感性增加相關(guān)。它通過抑制持續(xù)的NF-κB活性作為腫瘤抑制因子，阻止驅(qū)動細胞增殖和生存的信號。TNFAIP3的遺傳變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病和動脈粥樣硬化等疾病相關(guān)。

背景

TNFAIP3（A20）是一種重要的泛素編輯酶，由TNFAIP3基因編碼，是炎癥和免疫反應的關(guān)鍵負向調(diào)節(jié)因子。它在TNF-α、IL-1β和LPS等促炎刺激下迅速誘導，并主要作用于終止NF-κB信號傳導。TNFAIP3包含一個N端卵巢腫瘤（OTU）結(jié)構(gòu)域，具有去泛素化（DUB）活性，以及C端的多個鋅指（ZnF）結(jié)構(gòu)域，使其具有E3泛素連接酶和泛素結(jié)合能力。其雙重功能使得TNFAIP3能夠去除信號中介物如RIP1和TRAF6上的K63-連接泛素鏈，并添加K48-連接鏈，促使其被泛素酶體降解。通過編輯這些泛素鏈，TNFAIP3抑制NF-κB和MAPK通路的持續(xù)激活，從而防止過度的炎癥反應。TNFAIP3還表現(xiàn)出抗凋亡特性，特別是在胰腺β細胞和血管內(nèi)皮細胞中，幫助細胞在炎癥壓力下存活。TNFAIP3的功能缺失突變或其表達降低與自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和各種癌癥（尤其是B細胞淋巴瘤）的易感性增加相關(guān)。它通過抑制持續(xù)的NF-κB活性作為腫瘤抑制因子，阻止驅(qū)動細胞增殖和生存的信號。TNFAIP3的遺傳變異與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病和動脈粥樣硬化等疾病相關(guān)。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19643665/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%