Anti-DYKDDDDK Tag親和凝膠

Selleck Anti-DYKDDDDK Tag親和凝膠由高質(zhì)量的鼠源 IgG2b 單克隆抗體與sepharose 4B gel 通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)制備，本產(chǎn)品具有較高的DYKDDDDK Tag融合蛋白加載容量（至少為1.1mg protein /ml gel），雜蛋白非特異結(jié)合少，可用于蛋白質(zhì)免疫共沉淀和少量蛋白質(zhì)純化。

產(chǎn)品性質(zhì)

產(chǎn)品儲(chǔ)存溶劑

Selleck Anti-DYKDDDDK Tag Affinity Gel 儲(chǔ)存溶劑：10 mM Na₃PO₄, 150 mM NaCl, 50% 甘油, pH 7.4，含有0.02%（w/v）疊氮化鈉。

凝膠預(yù)處理

1、輕微重懸Anti-DYKDDDDK Tag Affinity Gel使均一，迅速轉(zhuǎn)移10 μL混合液（約5 μL純膠）至新的離心管中。
2、加入500 μL TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)，輕輕混勻，5,000 rpm離心30s，棄上清，重復(fù)上述步驟3-4次。

樣本的結(jié)合

3、上述的凝膠中加入50-200 μL細(xì)胞裂解液，然后室溫孵育2 h或4 ℃條件下過(guò)夜。
4、5,000 rpm離心30s，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中備用（上清液可用于檢測(cè)DYKDDDDK Tag蛋白是否存在殘留）。

洗滌

5、向上述沉淀中加入500 μL PBST（NaCl 136.89 mM; KCl 2.67 mM;Na₂HPO₄ 8.1 mM; KH₂PO₄ 1.76 mM；0.5% Tween20），用移液器輕柔地吹打重新分散凝膠，然后上下翻轉(zhuǎn)樣品5 min。5000rpm離心30s，棄上清。
6、重復(fù)上述步驟兩次。如遇到非特異性雜蛋白去除不干凈的情況，請(qǐng)延長(zhǎng)清洗時(shí)間、增加清洗次數(shù)或適當(dāng)增加清洗液中去垢劑的含量。

洗脫

根據(jù)下游用途選擇不同的洗脫方法，進(jìn)行免疫共沉淀可直接進(jìn)行7-8步；進(jìn)行蛋白純化可根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選擇多肽競(jìng)爭(zhēng)性洗脫（9-10步）或low pH洗脫（11-12步）

變性洗脫（適用于利用Anti-DYKDDDDK Tag Affinity Gel進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)）：

7、對(duì)于直接檢測(cè)目的蛋白的情況，在上述所得沉淀中加入50 μL 1×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，冷卻至室溫并離心。
8、取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

Poly DYKDDDDK Tag多肽競(jìng)爭(zhēng)性洗脫（適用于利用Anti-DYKDDDDK Tag Affinity Gel進(jìn)行蛋白純化實(shí)驗(yàn)）：

9、將含有200 ug-1 mg/ml Poly DYKDDDDK Tag多肽(B23111)的TBS緩沖液加入步驟6的產(chǎn)物中，Poly DYKDDDDK Tag多肽緩沖液體積為凝膠使用量的5倍，4℃搖床孵育洗脫2 hour（為了提高洗脫效率，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間或重復(fù)洗脫）
10、將上述步驟得到的產(chǎn)物進(jìn)行離心（5000rpm，30s），將包含目的蛋白的上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。凝膠如需重復(fù)使用，需用0.1M glycine HCl（pH 3.0）進(jìn)行清洗后再回收。

低pH洗脫（適用于利用Anti-DYKDDDDK Tag Affinity Gel進(jìn)行蛋白純化實(shí)驗(yàn)）：

11、將0.1M glycine HCl（pH 3.0）洗脫液加入步驟6中的產(chǎn)物中，洗脫液體積為凝膠使用量的5倍，搖床孵育洗脫5min，洗脫時(shí)間不得超過(guò)20 min。
12、將上述產(chǎn)物進(jìn)行離心（5000rpm，30s），將洗脫產(chǎn)物立即加入1M Tris（pH 8.0）進(jìn)行中和，并調(diào)節(jié)pH直至中性。

Selleck同時(shí)提供Poly DYKDDDDK Tag多肽凍干粉，可以更溫和有效地洗脫目標(biāo)蛋白產(chǎn)物。