細胞核與細胞漿蛋白抽提試劑盒

1. 試劑準備
室溫下融解試劑盒內(nèi)的三種試劑，融解后立即置于冰上并混勻。取適量細胞漿蛋白抽提試劑A，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑使其成為終濃度為1 ×的溶液。細胞核蛋白抽提試劑同理備用。

2. 貼壁細胞處理
用PBS清洗一次，再用細胞刮刮取細胞或用EDTA溶液處理使細胞貼壁松動后用移液器吹打收集。離心所收集的細胞，盡量吸盡上清，保留細胞沉淀。避免使用胰酶，以防目的蛋白降解。

3. 懸浮細胞處理
用PBS清洗一次，離心收集細胞，盡量去除上清，保留細胞沉淀。

4. 細胞裂解
每10 cm培養(yǎng)皿的細胞沉淀加入200 μL含蛋白酶抑制劑的細胞漿蛋白抽提試劑A。（以每10 cm 培養(yǎng)皿 HeLa細胞為例，細胞沉淀體積約20 μL或40 mg。）

5. 渦旋混勻
最高速渦旋5 s，使細胞完全懸浮、分散。如未完全懸浮，可適當延長時間。

6. 冰浴
靜置冰浴10~15 min。

7. 加入試劑B
加入10μL細胞漿蛋白抽提試劑B，最高速渦旋5 s，冰浴1 min。

8. 離心
最高速渦旋5 s后，在4℃、12,000-16,000g 條件下離心5 min。

9. 收集細胞漿蛋白
立即將上清轉(zhuǎn)移至預冷的塑料管，其中即為細胞漿蛋白，可立即使用或-80 ℃凍存。注意吸取上清時盡量避免接觸沉淀，可在其上方保留少量上清。（每10 cm 培養(yǎng)皿的細胞裂解后，所得細胞漿蛋白濃度約2~5mg/mL，具體視細胞類型而定。）

10. 細胞核蛋白提取
吸盡殘余上清后，加入50 μL含蛋白酶抑制劑的細胞核蛋白抽提試劑C。注意務必吸盡殘余上清，避免漿蛋白造成污染。

11. 渦旋與超聲
最高速渦旋15-30 s，使沉淀完全懸浮、分散。將其轉(zhuǎn)移至新的預冷PCR管中。超聲破碎（20%功率，超聲3 s，間隔1 s，循環(huán)3次）。注意確保探針位于液面下0.5 cm，避免液體濺出。

12. 細胞核蛋白離心
4℃、15,000g離心10 min。

13. 收集細胞核蛋白
立即將上清轉(zhuǎn)移至預冷塑料管，其中即為細胞核蛋白，可立即使用或-80 ℃凍存。每皿細胞裂解后所得細胞核蛋白濃度約1.2~3.0 mg/mL，具體濃度因細胞類型而異。

14. 新鮮組織處理
a. 混合細胞漿蛋白抽提試劑A和B（20:1），并加入蛋白酶抑制劑至終濃度為1×，配成裂解工作液冰上備用。將組織盡可能切碎，按60 mg組織/200μL工作液的比例混合，并在冰浴或4℃下充分勻漿。
b. 轉(zhuǎn)移勻漿液至新的預冷離心管，冰浴靜置15 min。
c. 4℃、1,500g離心5 min，收集上清即為部分細胞漿蛋白提取物。注意吸取上清液時盡量避免觸及沉淀。
d. 沉淀中仍包含大量未破碎的細胞，故繼續(xù)按照步驟4~13進行細胞漿蛋白和細胞核蛋白提取。注意若組織初重為30~60 mg可直接按原步驟操作，若初重小于30 mg，后續(xù)步驟4-13中使用的溶液用量減半。之后第二次提取得到的細胞漿蛋白可與14-c. 步驟中所得漿蛋白合并。（新鮮肝組織裂解后細胞漿蛋白濃度約3~10 mg/mL，細胞核蛋白濃度3~10 mg/mL，具體濃度因組織狀態(tài)而異。）