小鼠CD4⁺ T細(xì)胞分選試劑盒

小鼠CD4⁺ T 細(xì)胞分選試劑盒采用磁珠進(jìn)行陰性分選，從小鼠脾臟或淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液中分離出 CD4⁺ T 細(xì)胞（不區(qū)分naive CD4⁺ T細(xì)胞和非naive CD4⁺ T細(xì)胞）。原理是選用不同的生物素（biotin）標(biāo)記單克隆抗體對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞（非CD4⁺ T 細(xì)胞）進(jìn)行標(biāo)記，而后通過鏈霉親和素（streptavidin）標(biāo)記的磁珠對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行清除，從而達(dá)到小鼠CD4⁺ T 細(xì)胞分選的目的。分選過程需要用到磁力架。

應(yīng)用范圍

分選小鼠脾臟CD4⁺ T細(xì)胞

分選小鼠淋巴結(jié)CD4⁺ T細(xì)胞

應(yīng)用范圍

從 C57BL/6 小鼠脾臟細(xì)胞中分選 CD4⁺ T 細(xì)胞，分選前后的細(xì)胞用 FITC anti-mouse CD4 抗體（克隆號(hào)GK1.5）標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，分選前后的CD4⁺ T 細(xì)胞純度分別為 20.3%和 98.8%。

產(chǎn)品組成

以分選小鼠脾臟CD4⁺ T 細(xì)胞為例

1. 制備單細(xì)胞懸液：在70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于50 ml離心管中，500 g，離心5 min。
2. 離心完成后，棄上清，加入5 ml ACK紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解5 min，再加入20 ml PBS，500 g，離心5 min。
注意：紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液不同調(diào)整用量及時(shí)間。少量紅細(xì)胞殘留不會(huì)影響后續(xù)分選及細(xì)胞純度。
3. 離心完成后，棄上清，將脾細(xì)胞重懸于PBS，細(xì)胞懸液用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后，繼續(xù)以500 g，離心5 min。
4. 離心完成后，棄上清，將細(xì)胞重懸于分選buffer中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸ cells/ml。
注意：分選buffer為含有2 mM EDTA和2%胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2mM EDTA 和 0.5% BSA 的 PBS，需預(yù)先通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌。
5. 將 100 μl細(xì)胞懸液（1×10⁷ 個(gè)細(xì)胞）加入無菌流式管底部，再加入2 μl Biotin-Ab Mix，混勻后4℃孵育10 min。
注意：加入細(xì)胞懸液時(shí)將細(xì)胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據(jù)所使用磁力架特點(diǎn)也可使用離心管進(jìn)行細(xì)胞分選。如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加Biotin-Ab Mix用量。
6. 孵育完成后，在流式管中加入20 μl Streptavidin beads（使用前渦旋振蕩重懸磁珠），混勻后4℃孵育10 min。孵育過程中應(yīng)輕輕敲打管壁1~2次，防止細(xì)胞和beads沉降。
注意：如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加Streptavidin beads用量。例如分選5×10⁷細(xì)胞，則應(yīng)在500 μl細(xì)胞懸液中加入10 μl Biotin-Ab Mix和100 μl Streptavidin beads。如果分選少于1×10⁷ 個(gè)細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)至100 μl，使用2 μl Biotin-Ab Mix和20 μl Streptavidin beads。
7. 孵育完成后，在流式管加入2.5 ml分選buffer，以移液器上下混合吹打5次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。
8. 將含有細(xì)胞的分選流式管置于磁力架上（若沒有合適的磁力架，可將流式管中液體轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中再置于磁力架上），靜置5 min。
9. 將細(xì)胞懸液輕柔倒入無菌離心管中（傾倒過程中流式管不要脫離磁力架）或用吸管吸入離心管中（勿將液體吸盡，防止吸到磁珠），500 g，離心5 min。細(xì)胞懸液中即包含純化的小鼠CD4⁺ T細(xì)胞，離心后棄上清，收集細(xì)胞。
10. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于所需緩沖液或培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。