Anti-DYKDDDDK Tag免疫磁珠

磁珠預處理
1、用移液槍輕柔吹打重懸Anti-DYKDDDDK Tag免疫磁珠，轉移20 μL磁珠懸液到新的離心管中。
2、加入500 μL TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)，用移液槍輕柔吹打重懸磁珠，磁力架上靜置1~2 min（也可適當延長至5min），去除上清，重復上述步驟兩次。
注意：多個樣品時，可磁珠預處理后再分裝到各個反應管中。去除上清時，請用槍頭輕輕吸取，吸力過大可能會導致部分磁珠損失。
樣品的結合
3、在上述沉淀中加入200 μL細胞裂解液，用移液槍輕柔吹打重懸磁珠，然后室溫孵 育2 h或者4 ℃條件下過夜。
4、磁力架上靜置1-2 min（可適當延長）后，將上清液轉移到新的離心管中備用（上清液可用于檢測DYKDDDDK Tag蛋白是否存在殘留）。
洗滌
5、向上述沉淀中加入500 μL PBST (NaCl 136.89 mM; KCl 2.67 mM; Na2HPO4 8.1 mM; KH2PO4 1.76 mM; 0.5% Tween20)，用手輕敲或輕柔地吹打重新分散磁珠，然 后上下翻轉樣品5 min。磁性分離后移除上清。
6、重復上述步驟兩次。如遇到非特異性雜蛋白去除不干凈的情況，請延長清洗時間、 增加清洗次數(shù)或適當增加清洗液中去垢劑的含量。
蛋白洗脫
根據(jù)下游用途選擇不同的洗脫方法，進行免疫共沉淀可直接進行7-8步；進行蛋白純化可根據(jù)后續(xù)實驗，選擇多肽競爭性洗脫（9-10步）或低pH洗脫（11-12步）。
變性洗脫（適用于利用anti-DYKDDDDK Tag beads進行免疫共沉淀實驗）：
7、對于直接檢測目的蛋白的情況，在上述所得沉淀中加入50 μL 1×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，冷卻至室溫并在磁力架上靜置1-2 min（可適當延長）。
8、取上清進行SDS-PAGE檢測。
Poly DYKDDDDK Tag多肽競爭性洗脫（適用于利用anti-DYKDDDDK Tag beads進行蛋白純化實驗）：
9、將含有200 μg-1 mg/mL Poly DYKDDDDK Tag多肽（B23111）的TBS緩沖液加入步驟6的產物中，Poly DYKDDDDK Tag多肽緩沖液體積為磁珠使用量的5倍，4℃搖床孵育洗脫2 h（為了提高洗脫效率，可延長孵育時間或重復洗脫）。
10、將上述步驟得到的產物進行磁性分離，將包含目的蛋白的上清轉移到新的EP管中。磁珠如需重復使用，需用0.1 M glycine HCl (pH 3.0)進行清洗后再回收。
低pH洗脫（適用于利用anti-DYKDDDDK Tag beads進行蛋白純化實驗）：
11、將0.1 M glycine HCl (pH 3.0)洗脫液加入步驟6中的產物中，洗脫液體積為磁珠使用量的5倍，搖床孵育洗脫5 min，洗脫時間不得超過20 min。
12、將上述產物進行磁力分離，取洗脫產物立即加入1 M Tris (pH 8.0)進行中和，并調節(jié)pH直至中性。