Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)是一種氧化還原反應(yīng)的指示劑，在電子載體1-Methoxy PMS存在的條件下，利用活細(xì)胞中的脫氫酶催化四唑鹽WST?-8生成甲臜染料（圖1），而且甲臜染料的生成量與活細(xì)胞的數(shù)量成線性關(guān)系（圖2）。該試劑的靈敏度高于MTT、XTT、MTS或WST-1等其他四唑鹽。
Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞活性檢測(cè)試劑為一瓶即開即用的溶液，該試劑安全，無放射性，性價(jià)比高，為客戶提供方便、快速、可靠的使用體驗(yàn)。

圖1: Working mechanisms of Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

圖2: 使用Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和OD值的比較。按不同的密度將K562和Hela細(xì)胞接種在96孔板的100 μl培養(yǎng)基中（每個(gè)樣品進(jìn)行三個(gè)重復(fù)）. 培養(yǎng)16h后，在孔中添加10 μl Cell Counting Kit-8 (CCK-8)，并在培養(yǎng)箱按指定時(shí)間進(jìn)行孵育。用培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)光吸收值。

圖3: 使用Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和OD值的比較。按不同的密度將HEK293細(xì)胞接種在96孔板的100 μl培養(yǎng)基中（每個(gè)樣品進(jìn)行三個(gè)重復(fù)）. 培養(yǎng)16h后，在孔中添加10 μl Cell Counting Kit-8 (CCK-8)，并在培養(yǎng)箱按指定時(shí)間進(jìn)行孵育。用培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)光吸收值。

需要的實(shí)驗(yàn)器材

? 酶標(biāo)儀
? 多道移液器
? 3 % SDS（可選）

實(shí)驗(yàn)步驟

1) 接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶并使之生長4–24小時(shí)，然后開始檢測(cè)。
2) 在細(xì)胞培養(yǎng)液中直接加入1/10體積的Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)，充分混合，保證孔中顏色均一性，但不可有氣泡產(chǎn)生。對(duì)96孔板，每100μl培養(yǎng)液加入10μl活性檢測(cè)試劑。
3) 繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時(shí)至顏色變?yōu)槌壬缂?xì)胞密度/活力過低，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間至24小時(shí)，但需注意不可孵育過度。
4) 用酶標(biāo)儀讀取450nm光吸收值。典型的OD值在0.8-1.5之間，但0.5-2.5都是可接受的范圍。
注意：在添加Cell Counting Kit-8 (CCK-8)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，在450nm處會(huì)有輕微的自發(fā)吸收值。該背景值隨培養(yǎng)基、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、暴露于光線的時(shí)間等因素的變化而變化。典型的吸收值在孵育2小時(shí)后為0.1-0.2。為了糾正背景，準(zhǔn)備一個(gè)或多個(gè)無細(xì)胞的對(duì)照孔，計(jì)算其平均的OD值，然后從試驗(yàn)孔中扣除該值。
5) 可選步驟：在100μl細(xì)胞中加入10 μl 3 % SDS 以終止反應(yīng)，可在3天內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。
6) 細(xì)胞活力計(jì)算：
細(xì)胞活力*（％）=[A（藥物+）— A（空白）] / [A（藥物—）— A（空白）] ×100%
A（藥物+）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；
A（藥物—）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度；
A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度。
*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

實(shí)驗(yàn)簡要流程

應(yīng)用領(lǐng)域

1) 細(xì)胞增殖測(cè)定——Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)具有水溶性、穩(wěn)定性好、無細(xì)胞毒性。
2) 細(xì)胞活力檢測(cè)——細(xì)胞代謝活力與橙色的產(chǎn)生隨細(xì)胞活力的變化而變化。
3) 細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)——測(cè)定細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，克隆形成及生長。
4) 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)——有毒的化學(xué)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但死亡的細(xì)胞不會(huì)還原WST8，只有剩余的活細(xì)胞能夠顯色。Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8)本身對(duì)細(xì)胞無毒性。

注意事項(xiàng)

1. 使用前請(qǐng)充分混勻，避免反復(fù)凍融。
2. 如果長時(shí)間孵育（過夜），請(qǐng)確保在試劑添加與孵育期間維持無菌狀態(tài)。細(xì)菌也能夠是本試劑顯色。
3. 使用本品必須包含陽性、陰性和無細(xì)胞（純培養(yǎng)液）對(duì)照。
4. 本產(chǎn)品只能用于研究，不能用于藥物、日常生活等其他方面。