ATF3 Antibody [B23E24]

目錄號: F1121

如需獲取不同樣本的表達情況請點擊“樣品處理數(shù)據(jù)示例表”。

抗體應用：反應性：Human, Mouse

Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (KO ATF3), Lane 3: HepG2, Lane 4: 293T
Immunofluorescent analysis of Hela cells using F1121 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

客戶使用該產(chǎn)品的實驗數(shù)據(jù)

操作要點

WB
濕轉(zhuǎn)參考條件：200 mA, 60 min。
ATF3 存在兩個剪切體，可能出現(xiàn)雙條帶。
ATF3 本底表達低，建議先對其進行誘導刺激 (PMID: 19136462)。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:50-1:200 IF1:100 - 1:500 CHIP1:50-1:200

抗體應用
WB, IP, IF, ChIP

反應性
Human, Mouse

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預測分子量實際分子量
21 kDa 21 kDa
^*為什么預測分子量和實際分子量會有不同？以下原因可能會導致蛋白分子量與預測不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對電荷；多聚體。

陽性對照	Hap1; HeLa; A549; HCT116; HepG2; 293T; HEK-293; LnCap; THP-1 (treated with 80nM TPA overnight, then treated with 1 µg/mL LPS for 8 h) (PMID: 24973221); RAW 264.7 (treated with 1 µg/mL LPS for 2 h)(PMID: 24973221, PMID: 19136462)
陰性對照	Human liver; Mouse liver; Mouse heart; Jurkat; A431; THP-1; RAW 264.7; MEF

樣品處理數(shù)據(jù)示例

樣品	處理情況
LX-2	Medium Expression
PC-9	Low Expression
點擊查看更多樣品數(shù)據(jù)

^*該蛋白在不同的人源細胞、組織內(nèi)的表達量預測請參考：http://www.proteinatlas.org

樣品	處理情況

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

IF
實驗步驟：樣品準備 1. 貼壁細胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片。 2. 懸浮細胞：將細胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。 3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。 4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。通透 1. 對樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。（僅針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則可省略該步驟。） 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。封閉添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。免疫熒光染色（第一天） 1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。 2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。免疫熒光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。封片 1. 抗熒光淬滅封片劑封片。 2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。 3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

實驗步驟：

樣品準備

1. 貼壁細胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片。

2. 懸浮細胞：將細胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。

3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。

4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

通透

1. 對樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。

（僅針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則可省略該步驟。）

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

封閉

添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。

免疫熒光染色（第一天）

1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。

2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。

免疫熒光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。

封片

1. 抗熒光淬滅封片劑封片。

2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。

3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
ATF3 Antibody [B23E24] 檢測內(nèi)源性ATF3總蛋白水平。由于某些樣品中內(nèi)源性表達水平較低，可能需要刺激才能檢測到目標蛋白。

蛋白定位
細胞核

Uniprot ID
P18847

克隆號
B23E24

別名
ATF3

背景
激活轉(zhuǎn)錄因子3 (activated transcription factor 3, ATF3)是ATF/CREB家族的成員，與環(huán)AMP應答元件(cyclic AMP response element, CRE)結(jié)合，共識序列為TGACGTCA。它是一種應激誘導的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)代謝、免疫和腫瘤發(fā)生，在細胞適應性反應網(wǎng)絡(luò)中起中心樞紐作用。ATF3可由多種細胞外信號誘導，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞因子、趨化因子和LPS。

背景

激活轉(zhuǎn)錄因子3 (activated transcription factor 3, ATF3)是ATF/CREB家族的成員，與環(huán)AMP應答元件(cyclic AMP response element, CRE)結(jié)合，共識序列為TGACGTCA。它是一種應激誘導的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)代謝、免疫和腫瘤發(fā)生，在細胞適應性反應網(wǎng)絡(luò)中起中心樞紐作用。ATF3可由多種細胞外信號誘導，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、細胞因子、趨化因子和LPS。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32922364/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

技術(shù)支持

在訂購、運輸、儲存和使用我們的產(chǎn)品的任何階段，您遇到的任何問題，均可以通過撥打我們的熱線電話400-668-6834，或者技術(shù)支持郵箱[email protected]，直接聯(lián)系到我們。我們會在24小時內(nèi)盡快聯(lián)系您。

* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%