Caspase-1 Antibody [C2H20]

目錄號: F4192

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Mouse

Lane 1: A20, Lane 2: EL4, Lane 3: J774A.1

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:200

抗體應(yīng)用
WB, IP

反應(yīng)性
Mouse

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量
48 kDa

陽性對照	A20 cell; J774A.1 cell; JAWSII cell; M1 cell; EL4 cell; mBMDM cell (LPS, 50 ng/ml, 4 h)
陰性對照	3T3 cell

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Caspase-1 Antibody [C2H20] 可檢測內(nèi)源性 Caspase-1 總蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)膜系統(tǒng)

Uniprot ID
P29466

克隆號
C2H20

別名
Caspase-1; CASP-1; Interleukin-1 beta convertase; IL-1BC; Interleukin-1 beta-converting enzyme; IL-1 beta-converting enzyme; p45; CASP1; IL1BC; IL1BCE

背景
半胱天冬酶-1（白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶，ICE）與半胱天冬酶-4、-5、-11和-12同屬半胱天冬酶家族，是一種炎癥性半胱氨酸蛋白酶。它以無活性的45 kDa前體酶形式合成，對先天免疫反應(yīng)至關(guān)重要。半胱天冬酶-1具有一個用于炎癥小體組裝的N端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）、一個含有催化半胱氨酸殘基的大p20亞基和一個小p10亞基。這三個亞基通過鄰近誘導(dǎo)的二聚化和自身蛋白水解切割形成一個活性異源四聚體(p20)?(p10)?。 Caspase-1 在病原體相關(guān)分子模式或損傷信號觸發(fā)的多蛋白炎癥小體（NLRP3、AIM2、NLRC4/ASC）內(nèi)被激活，特異性地將前體IL-1β和前體IL-18切割成成熟的促炎細(xì)胞因子，從而驅(qū)動發(fā)熱、炎癥和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。同時，Caspase-1 還加工 gasdermin D，通過 N 端孔道形成誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致細(xì)胞溶解性死亡和 IL-1 釋放。Caspase-1 缺陷會選擇性地?fù)p害細(xì)胞因子成熟，并賦予細(xì)胞對內(nèi)毒素休克的抵抗力，但不影響細(xì)胞凋亡。

背景

半胱天冬酶-1（白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶，ICE）與半胱天冬酶-4、-5、-11和-12同屬半胱天冬酶家族，是一種炎癥性半胱氨酸蛋白酶。它以無活性的45 kDa前體酶形式合成，對先天免疫反應(yīng)至關(guān)重要。半胱天冬酶-1具有一個用于炎癥小體組裝的N端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）、一個含有催化半胱氨酸殘基的大p20亞基和一個小p10亞基。這三個亞基通過鄰近誘導(dǎo)的二聚化和自身蛋白水解切割形成一個活性異源四聚體(p20)?(p10)?。 Caspase-1 在病原體相關(guān)分子模式或損傷信號觸發(fā)的多蛋白炎癥小體（NLRP3、AIM2、NLRC4/ASC）內(nèi)被激活，特異性地將前體IL-1β和前體IL-18切割成成熟的促炎細(xì)胞因子，從而驅(qū)動發(fā)熱、炎癥和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。同時，Caspase-1 還加工 gasdermin D，通過 N 端孔道形成誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致細(xì)胞溶解性死亡和 IL-1 釋放。Caspase-1 缺陷會選擇性地?fù)p害細(xì)胞因子成熟，并賦予細(xì)胞對內(nèi)毒素休克的抵抗力，但不影響細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33116753/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19221555/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%