Cathepsin B Antibody [F22P14]

目錄號(hào): F3378

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Mouse, Rat

Lane 1: Mouse kidney, Lane 2: RAW 264.7, Lane 3: Rat thymus, Lane 4: Rat kidney
Immunofluorescent analysis of PC-12 cells using F3378 (green, 1:250), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價(jià)格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
濕轉(zhuǎn)參考條件：200 mA, 60 min。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IHC1:1000 IF1:250 FCM1:500

抗體應(yīng)用
WB, IHC, IF, FCM

反應(yīng)性
Mouse, Rat

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
38 kDa

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Cathepsin B Antibody [F22P14] 用于檢測(cè)內(nèi)源性 Cathepsin B 總的蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜，溶酶體，內(nèi)膜系統(tǒng)，細(xì)胞外環(huán)境

克隆號(hào)
F22P14

別名
Cathepsin B,G60, CTSB

背景
Cathepsin B是一種溶酶體半胱天冬酶，屬于木瓜蛋白酶家族。它最初以339個(gè)氨基酸的前酶形式合成，其中包含17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該前體經(jīng)過加工形成成熟酶，分子量為30 kDa，由一個(gè)25–26 kDa的重鏈和一個(gè)5 kDa的輕鏈通過二硫鍵連接。酶的催化三聯(lián)體由Cys29、His199和Asp219組成，使其具有內(nèi)肽酶和肽酰二肽酶活性。一個(gè)獨(dú)特的封閉環(huán)（Pro107–Asp124）通過鹽橋（His110–Asp22，Arg116–Asp224）穩(wěn)定酶，并調(diào)節(jié)其在酸性條件下的羧肽酶活性，而在中性pH時(shí)則轉(zhuǎn)向內(nèi)肽酶活性。在高爾基體中的翻譯后糖基化使得貓hepsin B帶有甘露糖-6-磷酸，指引其進(jìn)入溶酶體。進(jìn)入溶酶體后，酸性pH觸發(fā)酶的自催化激活。它還表現(xiàn)出連接酶活性，在特定條件下通過反向蛋白水解合成肽。它在凋亡中發(fā)揮重要作用，通過切割Bid促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素c的釋放。Cathepsin B還通過釋放從白蛋白降解中得到的半胱氨酸，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，影響鐵死亡。病理上，cathepsin B參與癌癥轉(zhuǎn)移，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的炎癥性關(guān)節(jié)損傷，并通過激活蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)（如將前uPA轉(zhuǎn)化為uPA，分解膠原）參與心血管重塑。

背景

Cathepsin B是一種溶酶體半胱天冬酶，屬于木瓜蛋白酶家族。它最初以339個(gè)氨基酸的前酶形式合成，其中包含17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該前體經(jīng)過加工形成成熟酶，分子量為30 kDa，由一個(gè)25–26 kDa的重鏈和一個(gè)5 kDa的輕鏈通過二硫鍵連接。酶的催化三聯(lián)體由Cys29、His199和Asp219組成，使其具有內(nèi)肽酶和肽酰二肽酶活性。一個(gè)獨(dú)特的封閉環(huán)（Pro107–Asp124）通過鹽橋（His110–Asp22，Arg116–Asp224）穩(wěn)定酶，并調(diào)節(jié)其在酸性條件下的羧肽酶活性，而在中性pH時(shí)則轉(zhuǎn)向內(nèi)肽酶活性。在高爾基體中的翻譯后糖基化使得貓hepsin B帶有甘露糖-6-磷酸，指引其進(jìn)入溶酶體。進(jìn)入溶酶體后，酸性pH觸發(fā)酶的自催化激活。它還表現(xiàn)出連接酶活性，在特定條件下通過反向蛋白水解合成肽。它在凋亡中發(fā)揮重要作用，通過切割Bid促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素c的釋放。Cathepsin B還通過釋放從白蛋白降解中得到的半胱氨酸，促進(jìn)谷胱甘肽的合成，影響鐵死亡。病理上，cathepsin B參與癌癥轉(zhuǎn)移，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的炎癥性關(guān)節(jié)損傷，并通過激活蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)（如將前uPA轉(zhuǎn)化為uPA，分解膠原）參與心血管重塑。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34291207/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37031185/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%