cGAS Antibody [L20A17]

目錄號(hào): F4205

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Mouse

Lane 1: 3T3, Lane 2: Neuro-2a, Lane 3: C2C12

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:200

抗體應(yīng)用
WB, IP

反應(yīng)性
Mouse

抗體類(lèi)型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
62 kDa

陽(yáng)性對(duì)照	3T3 cell; Neuro-2a cell; C2C12 cell
陰性對(duì)照

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
cGAS Antibody [L20A17] 可檢測(cè)內(nèi)源性 cGAS 總蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜，染色體，細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)膜系統(tǒng)，細(xì)胞核

Uniprot ID
Q8C6L5

克隆號(hào)
L20A17

別名
Cyclic GMP-AMP synthase; cGAMP synthase; cGAS; m-cGAS; 2'3'-cGAMP synthase; Mab-21 domain-containing protein 1; Cgas; Mb21d1

背景
環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cGAS）是CD-NTase超家族的核心胞質(zhì)DNA傳感器，對(duì)先天免疫防御至關(guān)重要。人cGAS由一個(gè)帶正電荷的N端結(jié)構(gòu)域組成，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)DNA結(jié)合并促進(jìn)與DNA的液-液相分離，從而保護(hù)DNA免受降解并增強(qiáng)cGAS的酶活性。C端催化結(jié)構(gòu)域包含NTase核心和保守的Mab21結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有α區(qū)、KRKR環(huán)和KKH環(huán)等基序，這些基序?qū)τ贒NA的識(shí)別和激活至關(guān)重要。cGAS與DNA結(jié)合后，發(fā)生二聚化和構(gòu)象變化，從而能夠利用ATP和GTP合成第二信使環(huán)狀GMP-AMP（cGAMP）。cGAMP隨后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)銜接蛋白STING結(jié)合，觸發(fā)STING的二聚化、結(jié)構(gòu)重排，并通過(guò)COPII復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。在 Golgi 體中，STING 被 TBK1 磷酸化，形成一個(gè)信號(hào)平臺(tái)，該平臺(tái)募集并激活 IRF3 和 NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo) I 型干擾素和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些因子對(duì)于抗病毒免疫至關(guān)重要。cGAS 與 DNA 發(fā)生相分離的能力可以放大信號(hào)傳導(dǎo)并防止 DNA 過(guò)早降解。核內(nèi) cGAS 的活性受到核小體結(jié)合的嚴(yán)格調(diào)控，核小體結(jié)合抑制 cGAS 的激活并防止自身免疫性疾病的發(fā)生。cGAS-STING 通路的失調(diào)與狼瘡等自身免疫性疾病密切相關(guān)，并且該通路在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著依賴(lài)于特定情境的雙重作用。

背景

環(huán)狀GMP-AMP合成酶（cGAS）是CD-NTase超家族的核心胞質(zhì)DNA傳感器，對(duì)先天免疫防御至關(guān)重要。人cGAS由一個(gè)帶正電荷的N端結(jié)構(gòu)域組成，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)DNA結(jié)合并促進(jìn)與DNA的液-液相分離，從而保護(hù)DNA免受降解并增強(qiáng)cGAS的酶活性。C端催化結(jié)構(gòu)域包含NTase核心和保守的Mab21結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有α區(qū)、KRKR環(huán)和KKH環(huán)等基序，這些基序?qū)τ贒NA的識(shí)別和激活至關(guān)重要。cGAS與DNA結(jié)合后，發(fā)生二聚化和構(gòu)象變化，從而能夠利用ATP和GTP合成第二信使環(huán)狀GMP-AMP（cGAMP）。cGAMP隨后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)銜接蛋白STING結(jié)合，觸發(fā)STING的二聚化、結(jié)構(gòu)重排，并通過(guò)COPII復(fù)合物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。在 Golgi 體中，STING 被 TBK1 磷酸化，形成一個(gè)信號(hào)平臺(tái)，該平臺(tái)募集并激活 IRF3 和 NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo) I 型干擾素和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些因子對(duì)于抗病毒免疫至關(guān)重要。cGAS 與 DNA 發(fā)生相分離的能力可以放大信號(hào)傳導(dǎo)并防止 DNA 過(guò)早降解。核內(nèi) cGAS 的活性受到核小體結(jié)合的嚴(yán)格調(diào)控，核小體結(jié)合抑制 cGAS 的激活并防止自身免疫性疾病的發(fā)生。cGAS-STING 通路的失調(diào)與狼瘡等自身免疫性疾病密切相關(guān)，并且該通路在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著依賴(lài)于特定情境的雙重作用。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35536585/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35485309/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

技術(shù)支持

在訂購(gòu)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用我們的產(chǎn)品的任何階段，您遇到的任何問(wèn)題，均可以通過(guò)撥打我們的熱線電話400-668-6834，或者技術(shù)支持郵箱[email protected]，直接聯(lián)系到我們。我們會(huì)在24小時(shí)內(nèi)盡快聯(lián)系您。

* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%