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COMT Antibody [E5A10]
目錄號: F4580
抗體應用：
反應性：
-
Lane 1: K562, Lane 2: SH-SY5Y
操作要點
WB
濕轉參考條件：200 mA, 60 min。
濕轉參考條件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀釋比例 |
|---|
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| 抗體應用 |
|---|
| WB, IP, IHC |
| 反應性 |
|---|
| Human |
| 抗體類型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 儲存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 儲存條件(自收到貨起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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預測分子量
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24 kDa, 28 kDa
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| 陽性對照 | Human prostate; Normal human breast; Normal human; Normal human liver; Normal human Kidney; Human prostate carcinoma; K-562 cell; SH-SY5Y cell |
|---|---|
| 陰性對照 |
實驗方法
| WB |
|---|
實驗步驟： 樣品制備
1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液測定蛋白質濃度；
6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。
電泳分離
1. 根據所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調 80 V, 30 min。然后電源調 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）
轉膜
1.拿出電轉槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉移緩沖液沖洗；
3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表 濕轉法參考條件：200 mA, 60 min。
（注意電轉條件可根據蛋白大小適當調節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉膜時間，但需要確保電轉槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）
封閉
1. 電轉移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗體孵育 1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；
4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
顯色
1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據二抗選擇其他顯色基質）混合均勻；
2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。
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| IHC |
|---|
實驗步驟：
脫蠟/補液
1. 脫蠟/水合切片：
2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。
3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。
4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。
5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
6.抗原修復：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰； 在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。 在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。
2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。
3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。
5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個切片 1 小時。
6. 除去封閉液，并向每個切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。
7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。 在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。
9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。
10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。
11. 在每個切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強度。
12. 將載玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用蘇木精復染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重復，孵育切片兩次，每次 10 秒； 在二甲苯中重復，孵育切片兩次，每次 10 秒。
16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。
|
生物描述
| 特異性 |
|---|
COMT Antibody [E5A10] 可檢測內源性COMT 總蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 細胞膜，細胞質，內膜系統(tǒng) |
| Uniprot ID |
|---|
| P21964 |
| 克隆號 |
|---|
| E5A10 |
| 別名 |
|---|
| catecholamine; dopamine; Parkinson; Parkinson's |
| 背景 |
|---|
COMT（兒茶酚-O-甲基轉移酶）是一種細胞內酶，負責兒茶酚類化合物（包括兒茶酚胺（多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素）、左旋多巴、兒茶酚雌激素和膳食多酚）的O-甲基化和失活。COMT基因位于22q11.2染色體上，編碼兩種亞型：可溶性COMT（S-COMT），主要在肝臟、腎臟和血液等外周組織中表達；膜結合型COMT（MB-COMT），主要存在于大腦，尤其是前額葉皮質，在調節(jié)細胞外多巴胺水平方面發(fā)揮關鍵作用。從結構上講，S-COMT位于細胞質和細胞核中，而MB-COMT與粗面內質網相關。 COMT 活性受常見的 Val158Met 多態(tài)性影響，其中 Met 變體會降低酶活性，從而導致多巴胺水平升高。雖然 COMT 主要存在于非神經元腦細胞（神經膠質細胞、脈絡叢）中，但它也在神經元中表達，這表明 COMT 與認知、情緒和攻擊等神經精神功能有關。 |
| 參考文獻 |
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