Cytochrome C Antibody [J5E3]

目錄號: F0194

抗體應用：反應性：Human, Mouse, Rat, Pigeon, Horse

Lane 1: Hela
Lane 2: Jurkat
Lane 3: COS
Lane 4: L929
Lane 5: C6
Lane 6: Bovine Cyt C

規(guī)格	價格	庫存
20ul	790	現貨
50uL	1240	現貨
100ul	1990	現貨
100uL*2	3790	現貨
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客戶使用Selleck的Cytochrome C Antibody [J5E3]發(fā)表文獻3篇

客戶使用該產品的實驗數據

操作要點

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：20%。
濕轉參考條件：200 mA, 60 min，建議使用 0.22 μm PVDF膜。

使用信息

稀釋比例
WB1:500

抗體應用
WB

反應性
Human, Mouse, Rat, Pigeon, Horse

抗體類型
Mouse Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預測分子量
15 kDa

陽性對照	mouse brain; mouse gastrocnemius; mouse adipose; HL-60; MOLM-13; HEK293T; SVG-A; HepG2; HCT 116; Jurkat; Hela; MCF-7; L929; C6
陰性對照

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：20 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調 80 V, 30 min。然后電源調 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉膜 1.拿出電轉槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉法參考條件：200 mA, 60 min。（注意電轉條件可根據蛋白大小適當調節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉膜時間，但需要確保電轉槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據二抗選擇其他顯色基質）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：20 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調 80 V, 30 min。然后電源調 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉膜

1.拿出電轉槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉法參考條件：200 mA, 60 min。

（注意電轉條件可根據蛋白大小適當調節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉膜時間，但需要確保電轉槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據二抗選擇其他顯色基質）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Cytochrome C Antibody [J5E3] 用于檢測內源性 Cytochrome C 總的蛋白水平。

蛋白定位
內膜，線粒體，線粒體內膜

Uniprot ID
Q01519

克隆號
J5E3

別名
Cytochrome-C

背景
細胞色素 c(Cytochrome c) 是一種小的水溶性蛋白質，分子量約為 12,000。它的主要功能是在線粒體內，通過參與電子傳輸鏈在 ATP 合成中發(fā)揮至關重要的作用。然而，響應細胞凋亡刺激，細胞色素 c 從線粒體釋放到細胞質中。一旦進入細胞質，細胞色素 c 就會與凋亡蛋白酶激活因子 1 (APAF1) 相互作用，形成稱為凋亡體的復合物。然后，該復合物激活 caspase-9，引發(fā)一系列級聯事件，最終導致細胞凋亡或程序性細胞死亡。

背景

細胞色素 c(Cytochrome c) 是一種小的水溶性蛋白質，分子量約為 12,000。它的主要功能是在線粒體內，通過參與電子傳輸鏈在 ATP 合成中發(fā)揮至關重要的作用。然而，響應細胞凋亡刺激，細胞色素 c 從線粒體釋放到細胞質中。一旦進入細胞質，細胞色素 c 就會與凋亡蛋白酶激活因子 1 (APAF1) 相互作用，形成稱為凋亡體的復合物。然后，該復合物激活 caspase-9，引發(fā)一系列級聯事件，最終導致細胞凋亡或程序性細胞死亡。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18568041/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%