Eg5 Antibody [K11B11]

目錄號(hào): F0946

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human

Lane 1: A-431, Lane 2: MCF7, Lane 3: COLO 205
Immunofluorescent analysis of 293T cells using F0946 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:100 IF1:100

抗體應(yīng)用
WB, IP, IF

反應(yīng)性
Human

抗體類(lèi)型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
120 kDa

陽(yáng)性對(duì)照	A431; MCF-7; COLO 205; 293T
陰性對(duì)照

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

IF
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品準(zhǔn)備 1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無(wú)菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。 2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴(lài)氨酸包被的潔凈無(wú)菌載玻片上。 3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。 4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。通透 1. 對(duì)樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。（僅針對(duì)胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。） 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。封閉添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或山羊血清。）注意事項(xiàng)：從封閉開(kāi)始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn)，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。免疫熒光染色（第一天） 1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。 2. 濕盒中 4°C 孵育過(guò)夜。免疫熒光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。封片 1. 抗熒光淬滅封片劑封片。 2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過(guò)夜。 3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品準(zhǔn)備

1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無(wú)菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。

2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴(lài)氨酸包被的潔凈無(wú)菌載玻片上。

3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。

4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

通透

1. 對(duì)樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。

（僅針對(duì)胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。）

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

封閉

添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事項(xiàng)：從封閉開(kāi)始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn)，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。

免疫熒光染色（第一天）

1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。

2. 濕盒中 4°C 孵育過(guò)夜。

免疫熒光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。

封片

1. 抗熒光淬滅封片劑封片。

2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過(guò)夜。

3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Eg5 Antibody [K11B11] 可檢測(cè)內(nèi)源性總 Eg5 的蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞骨架，微管

Uniprot ID
P52732

克隆號(hào)
K11B11

背景
驅(qū)動(dòng)蛋白-5 (Eg5)，又稱(chēng)為驅(qū)動(dòng)蛋白超家簇成員11(KIF11），是一種正端定向的同源四聚體微管運(yùn)動(dòng)蛋白，對(duì)有絲分裂紡錘體動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞功能有重要作用。從結(jié)構(gòu)上講，Eg5 是一種具有雙極結(jié)構(gòu)的同源四聚體，使其能夠交聯(lián)和滑動(dòng)反向平行微管，這對(duì)于有絲分裂期間雙極紡錘體的形成至關(guān)重要。與結(jié)合與其運(yùn)動(dòng)域相反的“貨物”的典型驅(qū)動(dòng)蛋白不同，Eg5 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其能夠交聯(lián)微管。在神經(jīng)元中，Eg5 在有絲分裂后細(xì)胞中表達(dá)，并通過(guò)充當(dāng)抑制因子來(lái)調(diào)控軸突生長(zhǎng)；它的缺失會(huì)導(dǎo)致軸突延伸更長(zhǎng)、更快。除了在有絲分裂中的作用外，Eg5 還在間期與核糖體結(jié)合，是高效蛋白質(zhì)合成所必需的，它將核糖體與微管連接起來(lái)，并需要其 ATPase 活性才能進(jìn)行正常翻譯。由于 Eg5 在細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)合成中起著關(guān)鍵作用，因此它是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，抑制其功能能破壞有絲分裂和細(xì)胞增殖。

背景

驅(qū)動(dòng)蛋白-5 (Eg5)，又稱(chēng)為驅(qū)動(dòng)蛋白超家簇成員11(KIF11），是一種正端定向的同源四聚體微管運(yùn)動(dòng)蛋白，對(duì)有絲分裂紡錘體動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞功能有重要作用。從結(jié)構(gòu)上講，Eg5 是一種具有雙極結(jié)構(gòu)的同源四聚體，使其能夠交聯(lián)和滑動(dòng)反向平行微管，這對(duì)于有絲分裂期間雙極紡錘體的形成至關(guān)重要。與結(jié)合與其運(yùn)動(dòng)域相反的“貨物”的典型驅(qū)動(dòng)蛋白不同，Eg5 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其能夠交聯(lián)微管。在神經(jīng)元中，Eg5 在有絲分裂后細(xì)胞中表達(dá)，并通過(guò)充當(dāng)抑制因子來(lái)調(diào)控軸突生長(zhǎng)；它的缺失會(huì)導(dǎo)致軸突延伸更長(zhǎng)、更快。除了在有絲分裂中的作用外，Eg5 還在間期與核糖體結(jié)合，是高效蛋白質(zhì)合成所必需的，它將核糖體與微管連接起來(lái)，并需要其 ATPase 活性才能進(jìn)行正常翻譯。由于 Eg5 在細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)合成中起著關(guān)鍵作用，因此它是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，抑制其功能能破壞有絲分裂和細(xì)胞增殖。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21795388/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%