EphA2 Antibody [A19C20]

目錄號(hào): F0477

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: COS-7, Lane 2: C6, Lane 3: miMCD-3, Lane 4: SNB19
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F0477 at 1/100 dilution.
Immunofluorescent analysis of A549 cells using F0477 (green, 1:200), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20ul	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100ul	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:100 IHC1:100 - 1:400 IF1:200 - 1:800

抗體應(yīng)用
WB, IP, IHC, IF

反應(yīng)性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
125 kDa

陽(yáng)性對(duì)照	SNB19; mIMCD-3; MDA-MB-231
陰性對(duì)照

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

IF
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品準(zhǔn)備 1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。 2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。 3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。 4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。封閉添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）注意事項(xiàng)：從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn)，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。免疫熒光染色（第一天） 1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。 2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。免疫熒光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。封片 1. 抗熒光淬滅封片劑封片。 2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。 3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品準(zhǔn)備

1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。

2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。

3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。

4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

封閉

添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事項(xiàng)：從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn)，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。

免疫熒光染色（第一天）

1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。

2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。

免疫熒光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。

封片

1. 抗熒光淬滅封片劑封片。

2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。

3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

IHC
實(shí)驗(yàn)步驟：脫蠟/補(bǔ)液 1. 脫蠟/水合切片： 2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。 3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。 4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。 5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。 2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。 3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。 5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。 6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。 7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。 9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。 11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。 12. 將載玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。 16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

IHC

實(shí)驗(yàn)步驟：

脫蠟/補(bǔ)液

1. 脫蠟/水合切片：

2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。

3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。

4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。

5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。

5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。

6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。

7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。

9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。

11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。

12. 將載玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。

16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
EphA2 Antibody [A19C20] 可識(shí)別總 EphA2 蛋白的內(nèi)源水平。

蛋白定位
細(xì)胞連接，細(xì)胞膜，細(xì)胞突起，內(nèi)膜

Uniprot ID
P29317

克隆號(hào)
A19C20

別名
Eck/EphA2,EphA2

背景
Eph 受體蛋白酪氨酸激酶 (Eph receptor protein tyrosine kinases, RPTK) 構(gòu)成了 RPTK 最大的亞家族，在脊椎動(dòng)物中有 16 個(gè)成員（人類有 14 個(gè)）。根據(jù)序列同源性和與肝配蛋白的配體結(jié)合特異性，將它們分為 EphA 和 EphB 激酶。 EphA 激酶與 GPI 錨定的肝配蛋白-As 結(jié)合，而 EphB 激酶則靶向跨膜肝配蛋白-B。 Eph/ephrin 相互作用在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的神經(jīng)模式中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，主要通過生長(zhǎng)錐和神經(jīng)元的排斥引導(dǎo)。 EphA2 最初被稱為上皮細(xì)胞激酶，具有致癌和抗腫瘤功能。位于染色體 1p36.13 上。體外研究表明，EphA2 的激活可抑制細(xì)胞遷移和增殖，并抑制 ephrin-A1 刺激誘導(dǎo)的 Ras/ERK1/2 信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而拮抗表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 和血小板源性生長(zhǎng)因子 (PDGF) 觸發(fā)的信號(hào)通路）。 EphA2 的激活在其生物學(xué)功能和下游信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

背景

Eph 受體蛋白酪氨酸激酶 (Eph receptor protein tyrosine kinases, RPTK) 構(gòu)成了 RPTK 最大的亞家族，在脊椎動(dòng)物中有 16 個(gè)成員（人類有 14 個(gè)）。根據(jù)序列同源性和與肝配蛋白的配體結(jié)合特異性，將它們分為 EphA 和 EphB 激酶。 EphA 激酶與 GPI 錨定的肝配蛋白-As 結(jié)合，而 EphB 激酶則靶向跨膜肝配蛋白-B。 Eph/ephrin 相互作用在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的神經(jīng)模式中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，主要通過生長(zhǎng)錐和神經(jīng)元的排斥引導(dǎo)。 EphA2 最初被稱為上皮細(xì)胞激酶，具有致癌和抗腫瘤功能。位于染色體 1p36.13 上。體外研究表明，EphA2 的激活可抑制細(xì)胞遷移和增殖，并抑制 ephrin-A1 刺激誘導(dǎo)的 Ras/ERK1/2 信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而拮抗表皮生長(zhǎng)因子 (EGF) 和血小板源性生長(zhǎng)因子 (PDGF) 觸發(fā)的信號(hào)通路）。 EphA2 的激活在其生物學(xué)功能和下游信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16849550/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%