HACE1 Antibody [A17B18]

目錄號: F3628

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Mouse, Rat, Human

Lane 1: HEK293, Lane 2: SH-SY5Y, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain

規(guī)格	價(jià)格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 - 1:10000

抗體應(yīng)用
WB

反應(yīng)性
Mouse, Rat, Human

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量實(shí)際分子量
102 kDa 102 kDa
^*為什么預(yù)測分子量和實(shí)際分子量會有不同？以下原因可能會導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對電荷；多聚體。

陽性對照	Rat brain; Mouse brain; Human fetal brain; HEK293; SH-SY5Y; 293T
陰性對照

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
HACE1 Antibody [A17B18] 可檢測內(nèi)源性 HACE1 總蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，內(nèi)膜系統(tǒng)

Uniprot ID
Q8IYU2

克隆號
A17B18

別名
KIAA1320, HACE1, E3 ubiquitin-protein ligase HACE1, HECT domain and ankyrin repeat-containing E3 ubiquitin-protein ligase 1, HECT-type E3 ubiquitin transferase HACE1

背景
HACE1（HECT結(jié)構(gòu)域和含錨蛋白重復(fù)序列的E3泛素蛋白連接酶1）基因位于6號染色體上，編碼一種由909個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。HACE1在多種人體組織中高表達(dá)，包括心臟、腦、胎盤、胰腺以及胎兒和成人腎臟。HACE1 mRNA在正常人體組織中普遍表達(dá)。HACE1表達(dá)水平降低與其基因位點(diǎn)上游兩個CpG島的高甲基化密切相關(guān)，提示表觀遺傳調(diào)控在其沉默中發(fā)揮作用。HACE1在多種癌癥中經(jīng)常下調(diào)，包括自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)、結(jié)直腸癌和胃癌。在亞細(xì)胞水平，HACE1主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)溶膠，但通常僅檢測到低水平的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。功能上，HACE1 作為 E3 泛素連接酶，與 E2 酶 UBCH7 協(xié)同催化靶蛋白的泛素化。它尤其參與磷酸化依賴的細(xì)胞周期蛋白 D1 的降解，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。HACE1 還優(yōu)先與小 GTP 酶 Rac1 的活性 GTP 結(jié)合形式結(jié)合，并促進(jìn)其多泛素化。這種活性對于 Rac1 在細(xì)胞毒性壞死因子 1 (CNF1) 刺激下的降解至關(guān)重要，從而促進(jìn)細(xì)菌入侵內(nèi)皮細(xì)胞單層，并突顯了 HACE1 在先天免疫防御機(jī)制中的作用。HACE1 的缺失會導(dǎo)致晚發(fā)型腫瘤的自發(fā)發(fā)展，進(jìn)一步支持了其作為腫瘤抑制因子的功能。該基因位于 6q21 染色體區(qū)域，該區(qū)域是多種人類癌癥的熱點(diǎn)區(qū)域，凸顯了其在腫瘤發(fā)生中的臨床意義。

背景

HACE1（HECT結(jié)構(gòu)域和含錨蛋白重復(fù)序列的E3泛素蛋白連接酶1）基因位于6號染色體上，編碼一種由909個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。HACE1在多種人體組織中高表達(dá)，包括心臟、腦、胎盤、胰腺以及胎兒和成人腎臟。HACE1 mRNA在正常人體組織中普遍表達(dá)。HACE1表達(dá)水平降低與其基因位點(diǎn)上游兩個CpG島的高甲基化密切相關(guān)，提示表觀遺傳調(diào)控在其沉默中發(fā)揮作用。HACE1在多種癌癥中經(jīng)常下調(diào)，包括自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤(NKTCL)、結(jié)直腸癌和胃癌。在亞細(xì)胞水平，HACE1主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)溶膠，但通常僅檢測到低水平的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。功能上，HACE1 作為 E3 泛素連接酶，與 E2 酶 UBCH7 協(xié)同催化靶蛋白的泛素化。它尤其參與磷酸化依賴的細(xì)胞周期蛋白 D1 的降解，從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。HACE1 還優(yōu)先與小 GTP 酶 Rac1 的活性 GTP 結(jié)合形式結(jié)合，并促進(jìn)其多泛素化。這種活性對于 Rac1 在細(xì)胞毒性壞死因子 1 (CNF1) 刺激下的降解至關(guān)重要，從而促進(jìn)細(xì)菌入侵內(nèi)皮細(xì)胞單層，并突顯了 HACE1 在先天免疫防御機(jī)制中的作用。HACE1 的缺失會導(dǎo)致晚發(fā)型腫瘤的自發(fā)發(fā)展，進(jìn)一步支持了其作為腫瘤抑制因子的功能。該基因位于 6q21 染色體區(qū)域，該區(qū)域是多種人類癌癥的熱點(diǎn)區(qū)域，凸顯了其在腫瘤發(fā)生中的臨床意義。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34815381/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38364733/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%