MALT1/MLT Antibody [P2K2]

目錄號: F2801

抗體應用：反應性：Human

Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (KO MALT1), Lane 3: Ramos, Lane 4: K562
Immunofluorescent analysis of Jurkat cells using F2801 (green, 1:250), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價格	庫存
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 - 1:10000 IP1:50 IF1:250 FCM1:100

抗體應用
WB, IP, IF, FCM

反應性
Human

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預測分子量實際分子量
92 kDa 92 kDa
^*為什么預測分子量和實際分子量會有不同？以下原因可能會導致蛋白分子量與預測不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構體；相對電荷；多聚體。

陽性對照	HCT 116 cell; HeLa cell; Ramos cell; K562 cell; Jurkat cell
陰性對照

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

IF
實驗步驟：標本制備 1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細胞至 2-3 mm 的深度。注意：多聚甲醛有毒，只能在通風櫥中使用。 2. 室溫固定細胞 15 分鐘。 3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。 4. 繼續(xù)進行免疫染色。免疫染色 1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。 2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。 3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。 4. 4°C 孵育過夜。 5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。 6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時。 7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。 8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。 9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。如需長期保存，請將載玻片平放在 23°C 避光保存。

實驗步驟：

標本制備

1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細胞至 2-3 mm 的深度。

注意：多聚甲醛有毒，只能在通風櫥中使用。

2. 室溫固定細胞 15 分鐘。

3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

4. 繼續(xù)進行免疫染色。

免疫染色

1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。

2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。

3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。

4. 4°C 孵育過夜。

5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時。

7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。

9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。如需長期保存，請將載玻片平放在 23°C 避光保存。

IF
實驗步驟：樣品準備 1. 貼壁細胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片。 2. 懸浮細胞：將細胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。 3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。 4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。通透 1. 對樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。（僅針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則可省略該步驟。） 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。封閉添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。免疫熒光染色（第一天） 1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。 2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。免疫熒光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。封片 1. 抗熒光淬滅封片劑封片。 2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。 3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

實驗步驟：

樣品準備

1. 貼壁細胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片。

2. 懸浮細胞：將細胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。

3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。

4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

通透

1. 對樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。

（僅針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則可省略該步驟。）

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

封閉

添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。

免疫熒光染色（第一天）

1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。

2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。

免疫熒光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。

封片

1. 抗熒光淬滅封片劑封片。

2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。

3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
MALT1/MLT Antibody [P2K2] 可檢測內(nèi)源性 MALT1/MLT 總蛋白水平。

蛋白定位
細胞質(zhì)，細胞核

Uniprot ID
Q9UDY8

克隆號
P2K2

別名
MLT, MALT1, Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT lymphoma-associated translocation, Paracaspase

背景
MALT1/MLT（粘膜相關淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1），又稱副胱天蛋白酶1，是一種廣泛表達的信號蛋白，在免疫信號通路中發(fā)揮支架和精氨酸特異性蛋白酶的雙重作用。MALT1的結構包含一個N端死亡結構域(DD)，隨后是兩個免疫球蛋白樣結構域、一個中心副胱天蛋白酶催化結構域和一個C端免疫球蛋白樣結構域，后者可穩(wěn)定和調(diào)節(jié)蛋白酶活性。與經(jīng)典胱天蛋白酶不同，MALT1保持為單個未裂解的多肽形式，并通過二聚化激活，其副胱天蛋白酶結構域在結構上與胱天蛋白酶相似，但能夠特異性地識別和裂解精氨酸殘基之后的底物。功能上，MALT1是CARMA1-BCL10-MALT1 (CBM)信號體的核心組成部分，它募集E3連接酶（例如TRAF6），并促進下游NF-κB和JNK通路的激活，從而調(diào)節(jié)淋巴細胞的活化、增殖和存活。MALT1通過其蛋白酶活性，裂解NF-κB信號轉(zhuǎn)導的關鍵負調(diào)控因子（例如A20和CYLD），從而微調(diào)免疫反應；同時，其支架功能則組織對適應性免疫和淋巴瘤形成至關重要的信號復合物。

背景

MALT1/MLT（粘膜相關淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1），又稱副胱天蛋白酶1，是一種廣泛表達的信號蛋白，在免疫信號通路中發(fā)揮支架和精氨酸特異性蛋白酶的雙重作用。MALT1的結構包含一個N端死亡結構域(DD)，隨后是兩個免疫球蛋白樣結構域、一個中心副胱天蛋白酶催化結構域和一個C端免疫球蛋白樣結構域，后者可穩(wěn)定和調(diào)節(jié)蛋白酶活性。與經(jīng)典胱天蛋白酶不同，MALT1保持為單個未裂解的多肽形式，并通過二聚化激活，其副胱天蛋白酶結構域在結構上與胱天蛋白酶相似，但能夠特異性地識別和裂解精氨酸殘基之后的底物。功能上，MALT1是CARMA1-BCL10-MALT1 (CBM)信號體的核心組成部分，它募集E3連接酶（例如TRAF6），并促進下游NF-κB和JNK通路的激活，從而調(diào)節(jié)淋巴細胞的活化、增殖和存活。MALT1通過其蛋白酶活性，裂解NF-κB信號轉(zhuǎn)導的關鍵負調(diào)控因子（例如A20和CYLD），從而微調(diào)免疫反應；同時，其支架功能則組織對適應性免疫和淋巴瘤形成至關重要的信號復合物。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22309193/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38863711/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%