mTOR Antibody [L10A18]

目錄號(hào): F2516

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Mouse, Rat, Human

Lane 1: MCF7, Lane 2: HepG2, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。
濕轉(zhuǎn)參考條件：250 mA, 180 min。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 - 1:5000 IP1:50 - 1:100 IHC1:400

抗體應(yīng)用
WB, IP, IHC

反應(yīng)性
Mouse, Rat, Human

抗體類(lèi)型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量實(shí)際分子量
289 kDa 250 kDa
^*為什么預(yù)測(cè)分子量和實(shí)際分子量會(huì)有不同？以下原因可能會(huì)導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測(cè)不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對(duì)電荷；多聚體。

陽(yáng)性對(duì)照	Human breast carcinoma; Human heart; Rat testis; Rat brain; Mouse testis; Mouse brain; Mouse heart; Mouse thymus; Mouse lung; HeLa cell; A549 cell; HepG2 cell; HEK-293 cell; MCF7 cell; HaCaT cell; MDA-MB-231 cell
陰性對(duì)照	Human fetal lung; Rat heart; Rat liver; Rat spleen; Rat thymus; Rat lung; Mouse kidney; Mouse liver

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：250 mA, 180 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：250 mA, 180 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

IHC
實(shí)驗(yàn)步驟：脫蠟/補(bǔ)液 1. 脫蠟/水合切片： 2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。 3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。 4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。 5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開(kāi)始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。 2. 將切片在 3% 過(guò)氧化氫中孵育 10 分鐘。 3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。 5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。 6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過(guò)夜。 7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。 9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。 11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。 12. 將載玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。 16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

IHC

實(shí)驗(yàn)步驟：

脫蠟/補(bǔ)液

1. 脫蠟/水合切片：

2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。

3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。

4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。

5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開(kāi)始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

2. 將切片在 3% 過(guò)氧化氫中孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。

5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。

6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過(guò)夜。

7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。

9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。

11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。

12. 將載玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。

16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
mTOR Antibody [L10A18] 可檢測(cè)內(nèi)源性 mTOR 總蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)囊泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，溶酶體，細(xì)胞核，微粒體，線(xiàn)粒體

Uniprot ID
P42345

克隆號(hào)
L10A18

別名
FRAP, FRAP1, FRAP2, RAFT1, RAPT1, MTOR, Serine/threonine-protein kinase mTOR, FK506-binding protein 12-rapamycin complex-associated protein 1, FKBP12-rapamycin complex-associated protein, Mammalian target of rapamycin, Mechanistic target of rapamycin, Rapamycin and FKBP12 target 1, Rapamycin target protein 1, mTOR

背景
mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PI3K相關(guān)激酶（PIKK）家族，是兩種不同復(fù)合物的催化核心：mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）。mTORC1由三個(gè)必需亞基組成——mTOR、Raptor（mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白）和mLST8（哺乳動(dòng)物致死Sec13蛋白8，也稱(chēng)為GβL）。細(xì)胞為了生長(zhǎng)和增殖，必須增強(qiáng)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成，同時(shí)抑制自噬等分解代謝途徑。mTORC1通過(guò)整合環(huán)境因素來(lái)調(diào)節(jié)合成代謝和分解代謝過(guò)程，從而協(xié)調(diào)這種平衡。mTORC1的主要作用之一是刺激蛋白質(zhì)合成。它通過(guò)磷酸化兩個(gè)主要的下游效應(yīng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)：p70 S6激酶1 (S6K1) 和 eIF4E 結(jié)合蛋白 (4EBP)。具體而言，mTORC1 磷酸化疏水基序內(nèi) Thr389 位點(diǎn)的 S6K1，從而實(shí)現(xiàn)隨后由 PDK1 激活。除了蛋白質(zhì)合成之外，mTORC1 還通過(guò)主動(dòng)抑制自噬和其他分解代謝途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。相反，mTORC2 主要通過(guò)磷酸化 AGC 激酶家族成員（PKA、PKG 和 PKC）來(lái)調(diào)節(jié)增殖和存活。其最關(guān)鍵的功能是磷酸化和激活 Akt，Akt 是胰島素/PI3K 信號(hào)傳導(dǎo)的中心效應(yīng)物。活化的 Akt 通過(guò)磷酸化和抑制關(guān)鍵底物（包括 FoxO1/3a 轉(zhuǎn)錄因子、代謝調(diào)節(jié)因子 GSK3β 和 mTORC1 上游抑制劑 TSC2）來(lái)驅(qū)動(dòng)存活、生長(zhǎng)和增殖。此外，mTORC2 激活 SGK1，另一種影響離子運(yùn)輸和細(xì)胞存活的 AGC 激酶。

背景

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PI3K相關(guān)激酶（PIKK）家族，是兩種不同復(fù)合物的催化核心：mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）。mTORC1由三個(gè)必需亞基組成——mTOR、Raptor（mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白）和mLST8（哺乳動(dòng)物致死Sec13蛋白8，也稱(chēng)為GβL）。細(xì)胞為了生長(zhǎng)和增殖，必須增強(qiáng)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核苷酸的合成，同時(shí)抑制自噬等分解代謝途徑。mTORC1通過(guò)整合環(huán)境因素來(lái)調(diào)節(jié)合成代謝和分解代謝過(guò)程，從而協(xié)調(diào)這種平衡。mTORC1的主要作用之一是刺激蛋白質(zhì)合成。它通過(guò)磷酸化兩個(gè)主要的下游效應(yīng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)：p70 S6激酶1 (S6K1) 和 eIF4E 結(jié)合蛋白 (4EBP)。具體而言，mTORC1 磷酸化疏水基序內(nèi) Thr389 位點(diǎn)的 S6K1，從而實(shí)現(xiàn)隨后由 PDK1 激活。除了蛋白質(zhì)合成之外，mTORC1 還通過(guò)主動(dòng)抑制自噬和其他分解代謝途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。相反，mTORC2 主要通過(guò)磷酸化 AGC 激酶家族成員（PKA、PKG 和 PKC）來(lái)調(diào)節(jié)增殖和存活。其最關(guān)鍵的功能是磷酸化和激活 Akt，Akt 是胰島素/PI3K 信號(hào)傳導(dǎo)的中心效應(yīng)物。活化的 Akt 通過(guò)磷酸化和抑制關(guān)鍵底物（包括 FoxO1/3a 轉(zhuǎn)錄因子、代謝調(diào)節(jié)因子 GSK3β 和 mTORC1 上游抑制劑 TSC2）來(lái)驅(qū)動(dòng)存活、生長(zhǎng)和增殖。此外，mTORC2 激活 SGK1，另一種影響離子運(yùn)輸和細(xì)胞存活的 AGC 激酶。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28283069/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%