NLRP3 Antibody [K12J9]

目錄號: F3229

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: THP-1, Lane 2: THP-1 (KO NLRP3), Lane 3: RAW 264.7, Lane 4: RAW 264.7 (LPS, 10 μg/ml, 8 h)

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。
NLRP3在部分細(xì)胞\組織中表達(dá)豐度較低，WB實驗前需要確認(rèn)表達(dá)量，同時建議選取陽性對照(如THP-1)一同開展實驗。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:30 FCM1:50

抗體應(yīng)用
WB, IP, FCM

反應(yīng)性
Human, Mouse, Rat

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量
118 kDa

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
NLRP3 Antibody [K12J9] 用于檢測內(nèi)源性 NLRP3 總的蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞骨架，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，內(nèi)膜系統(tǒng)，線粒體，細(xì)胞核，細(xì)胞外環(huán)境

克隆號
K12J9

別名
Cryopyrin/NALP3/NLRP3,NLRP3,NLRP3/NALP3

背景
NLRP3炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)中的一個重要蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)檢測各種病原和損傷相關(guān)的分子模式（PAMPs和DAMPs）。它在啟動炎癥反應(yīng)中起著核心作用，通過激活半胱天冬酶-1（caspase-1），后者處理并釋放促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18，這些是炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)。NLRP3炎癥小體由感應(yīng)蛋白NLRP3、適配蛋白ASC和半胱天冬酶-1組成。在識別應(yīng)激信號（如感染、細(xì)胞損傷或環(huán)境晶體，如痛風(fēng)中的尿酸）后，NLRP3發(fā)生構(gòu)象變化，聚合并招募ASC，激活半胱天冬酶-1。NLRP3的激活由鉀離子外流、活性氧（ROS）產(chǎn)生和線粒體功能障礙等細(xì)胞事件引發(fā)，這些事件促進(jìn)炎癥小體的組裝。作為對刺激的反應(yīng)，NLRP3還可能通過翻譯后修飾如磷酸化、泛素化和硝基化進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些都影響其激活或抑制。NLRP3的組裝觸發(fā)炎癥小體斑點的形成，激活下游信號通路，最終導(dǎo)致焦亡（一種程序性細(xì)胞死亡）。這些復(fù)雜的機(jī)制確保NLRP3在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)同時維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

背景

NLRP3炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)中的一個重要蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)檢測各種病原和損傷相關(guān)的分子模式（PAMPs和DAMPs）。它在啟動炎癥反應(yīng)中起著核心作用，通過激活半胱天冬酶-1（caspase-1），后者處理并釋放促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18，這些是炎癥的關(guān)鍵介質(zhì)。NLRP3炎癥小體由感應(yīng)蛋白NLRP3、適配蛋白ASC和半胱天冬酶-1組成。在識別應(yīng)激信號（如感染、細(xì)胞損傷或環(huán)境晶體，如痛風(fēng)中的尿酸）后，NLRP3發(fā)生構(gòu)象變化，聚合并招募ASC，激活半胱天冬酶-1。NLRP3的激活由鉀離子外流、活性氧（ROS）產(chǎn)生和線粒體功能障礙等細(xì)胞事件引發(fā)，這些事件促進(jìn)炎癥小體的組裝。作為對刺激的反應(yīng)，NLRP3還可能通過翻譯后修飾如磷酸化、泛素化和硝基化進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些都影響其激活或抑制。NLRP3的組裝觸發(fā)炎癥小體斑點的形成，激活下游信號通路，最終導(dǎo)致焦亡（一種程序性細(xì)胞死亡）。這些復(fù)雜的機(jī)制確保NLRP3在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)同時維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31284572/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%