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Oct4 Antibody [L11C12]
目錄號: F0104
抗體應(yīng)用：
反應(yīng)性：
-
Lane 1: NCCIT, Lane 2: F9 -
Immunofluorescent analysis of NCCIT cells using F0104 (green, 1:250), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
操作要點
WB
濕轉(zhuǎn)參考條件：200 mA, 60 min。
使用信息
| 稀釋比例 |
|---|
|
| 抗體應(yīng)用 |
|---|
| WB, IP, IHC, IF, FCM, ChIP |
| 反應(yīng)性 |
|---|
| Human, Mouse |
| 抗體類型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 儲存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN? |
| 儲存條件(自收到貨起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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預(yù)測分子量
實際分子量
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|---|
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39 kDa
45 kDa
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| *為什么預(yù)測分子量和實際分子量會有不同？ 以下原因可能會導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對電荷；多聚體。 |
實驗方法
| WB |
|---|
實驗步驟： 樣品制備
1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；
6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。
電泳分離
1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）
轉(zhuǎn)膜
1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；
3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表 濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。
（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）
封閉
1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗體孵育 1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；
4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
顯色
1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；
2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。
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| IF |
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實驗步驟：
樣品準備
1. 貼壁細胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片。
2. 懸浮細胞：將細胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。
3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。
4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復(fù)。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。
通透
1. 對樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。
（僅針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則可省略該步驟。）
2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。
封閉
添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。
免疫熒光染色（第一天）
1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。
2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。
免疫熒光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。
封片
1. 抗熒光淬滅封片劑封片。
2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。
3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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| IF |
|---|
實驗步驟：
標本制備
1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通風(fēng)櫥中使用。
2. 室溫固定細胞 15 分鐘。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
4. 繼續(xù)進行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。
2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。
3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。
4. 4°C 孵育過夜。
5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時。
7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。
9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。 如需長期保存，請將載玻片平放在 57°C 避光保存。
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| IHC |
|---|
實驗步驟：
脫蠟/補液
1. 脫蠟/水合切片：
2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。
3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。
4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。
5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
6.抗原修復(fù)：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰； 在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。 在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。
2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。
3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。
5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個切片 1 小時。
6. 除去封閉液，并向每個切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。
7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。 在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。
9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。
10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。
11. 在每個切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強度。
12. 將載玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒； 在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。
16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。
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生物描述
| 特異性 |
|---|
Oct4 Antibody [L11C12] 可識別內(nèi)源性總 Oct4 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 細胞質(zhì)，細胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q01860 |
| 克隆號 |
|---|
| L11C12 |
| 別名 |
|---|
| OCT3, OTF3, POU5F1, Octamer-binding protein 3, Octamer-binding protein 4, Octamer-binding transcription factor 3, Oct-3, OTF-3 |
| 背景 |
|---|
Octamer-binding transcription factor 4（八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4，Oct4），由高度保守的POU5F1基因編碼，是在早期胚胎發(fā)育和生殖細胞系中維持多能性的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)構(gòu)上，Oct4是一個由324個氨基酸組成的蛋白，包含三個主要結(jié)構(gòu)域：一個N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、一個中央的POU特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它識別八聚體基序（5′-ATTTGCAT-3′），以及一個C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。包括Oct4A、Oct4B和Oct4B1在內(nèi)的多個亞型，在其N端區(qū)域和生物學(xué)作用上有所不同。Oct4在多能性細胞如胚胎干細胞、囊胚的內(nèi)細胞團和原始生殖細胞以及未成熟卵母細胞中高度表達。其表達受到嚴格調(diào)控——無論是上調(diào)還是下調(diào)，都可能破壞多能性的平衡并推動細胞向分化方向發(fā)展。除了發(fā)育方面，Oct4在多種癌癥中的異常表達也被觀察到，它可能有助于腫瘤生成潛力和癌癥干細胞樣特性。 |
| 參考文獻 |
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