PAR2 Antibody [N9E12]

目錄號(hào): F1136

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: HepG2, Lane 2: Rat kidney lysate
Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Colorectal cancer tissue with F1136 at 1/100 dilution.
Immunofluorescent analysis of HepG2 cells using F1136 (green, 1:50), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
濕轉(zhuǎn)參考條件：200 mA, 60 min。
請(qǐng)勿煮樣，煮樣易造成后續(xù)無(wú)法檢測(cè)到條帶、條帶背景較深、位置不對(duì)或拖尾嚴(yán)重。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000-1:10000 IHC1:200 IF1:200 - 1:400 FCM1:200 - 1:800

抗體應(yīng)用
WB, IHC, IF, FCM

反應(yīng)性
Human, Mouse, Rat

抗體類(lèi)型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量實(shí)際分子量
32 kDa 44 kDa
^*為什么預(yù)測(cè)分子量和實(shí)際分子量會(huì)有不同？以下原因可能會(huì)導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測(cè)不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對(duì)電荷；多聚體。

陽(yáng)性對(duì)照	human kidney; human kidney; mouse kidney; mouse kidney; rat kidney; MCF-7; HT-29 ; HepG2
陰性對(duì)照	Daudi

實(shí)驗(yàn)方法


實(shí)驗(yàn)步驟：脫蠟/補(bǔ)液 1. 脫蠟/水合切片： 2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。 3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。 4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。 5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開(kāi)始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。 2. 將切片在 3% 過(guò)氧化氫中孵育 10 分鐘。 3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。 5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。 6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過(guò)夜。 7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。 9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。 11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。 12. 將載玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。 16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

實(shí)驗(yàn)步驟：

脫蠟/補(bǔ)液

1. 脫蠟/水合切片：

2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。

3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。

4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。

5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開(kāi)始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

2. 將切片在 3% 過(guò)氧化氫中孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。

5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。

6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過(guò)夜。

7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。

9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。

11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。

12. 將載玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。

16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 在 20 μL 樣品中加入蛋白上樣緩沖液，可直接冰上備用；或通過(guò)溫度梯度（如37 ℃煮樣、50 ℃煮樣、70 ℃煮樣、90 ℃煮樣、100 ℃煮樣）來(lái)確定最佳變性條件，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀(guān)察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 在 20 μL 樣品中加入蛋白上樣緩沖液，可直接冰上備用；或通過(guò)溫度梯度（如37 ℃煮樣、50 ℃煮樣、70 ℃煮樣、90 ℃煮樣、100 ℃煮樣）來(lái)確定最佳變性條件，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀(guān)察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

IF
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品準(zhǔn)備 1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無(wú)菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。 2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴(lài)氨酸包被的潔凈無(wú)菌載玻片上。 3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。 4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。封閉添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或山羊血清。）注意事項(xiàng)：從封閉開(kāi)始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn)，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。免疫熒光染色（第一天） 1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。 2. 濕盒中 4°C 孵育過(guò)夜。免疫熒光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。封片 1. 抗熒光淬滅封片劑封片。 2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過(guò)夜。 3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品準(zhǔn)備

1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無(wú)菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。

2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴(lài)氨酸包被的潔凈無(wú)菌載玻片上。

3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。

4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

封閉

添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事項(xiàng)：從封閉開(kāi)始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn)，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。

免疫熒光染色（第一天）

1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。

2. 濕盒中 4°C 孵育過(guò)夜。

免疫熒光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。

封片

1. 抗熒光淬滅封片劑封片。

2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過(guò)夜。

3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
PAR2 Antibody [N9E12] 可識(shí)別內(nèi)源性總PAR2蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜

Uniprot ID
P55085

克隆號(hào)
N9E12

別名
PAR2

背景
蛋白酶激活受體 2 (PAR-2) 是 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 家族的成員，由胰蛋白酶、肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶和凝血因子 VIIa 和 Xa 等蛋白酶激活。其細(xì)胞外 N 端結(jié)構(gòu)域的裂解會(huì)暴露出一個(gè)可激活受體的栓配體，從而啟動(dòng)下游信號(hào)通路。PAR-2 存在于感覺(jué)神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，尤其是在動(dòng)脈和呼吸系統(tǒng)中。它的激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥和痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)，并通過(guò) ASIC 和 TRPV1 通道增強(qiáng)感覺(jué)神經(jīng)元中的酸誘發(fā)反應(yīng)。它在肝臟胰島素抵抗和葡萄糖代謝中起著至關(guān)重要的作用。它通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和肝臟胰島素信號(hào)傳導(dǎo)與非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 有關(guān)。在免疫介導(dǎo)的損傷中，PAR-2 通過(guò)促進(jìn)炎癥加劇組織損傷，而在直接組織損傷中，它促進(jìn)再生和愈合。PAR-2 調(diào)節(jié)疼痛信號(hào)、炎癥性腸病、肺部和哮喘反應(yīng)、胰腺炎、皮膚刺激和瘙癢。

背景

蛋白酶激活受體 2 (PAR-2) 是 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 家族的成員，由胰蛋白酶、肥大細(xì)胞類(lèi)胰蛋白酶和凝血因子 VIIa 和 Xa 等蛋白酶激活。其細(xì)胞外 N 端結(jié)構(gòu)域的裂解會(huì)暴露出一個(gè)可激活受體的栓配體，從而啟動(dòng)下游信號(hào)通路。PAR-2 存在于感覺(jué)神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，尤其是在動(dòng)脈和呼吸系統(tǒng)中。它的激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥和痛覺(jué)過(guò)敏反應(yīng)，并通過(guò) ASIC 和 TRPV1 通道增強(qiáng)感覺(jué)神經(jīng)元中的酸誘發(fā)反應(yīng)。它在肝臟胰島素抵抗和葡萄糖代謝中起著至關(guān)重要的作用。它通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和肝臟胰島素信號(hào)傳導(dǎo)與非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 有關(guān)。在免疫介導(dǎo)的損傷中，PAR-2 通過(guò)促進(jìn)炎癥加劇組織損傷，而在直接組織損傷中，它促進(jìn)再生和愈合。PAR-2 調(diào)節(jié)疼痛信號(hào)、炎癥性腸病、肺部和哮喘反應(yīng)、胰腺炎、皮膚刺激和瘙癢。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35603482/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38816842/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%