• <dfn id="q240u"></dfn>
    • PDGFR α Antibody [P1E17]

      目錄號(hào): F3240

        抗體應(yīng)用: 反應(yīng)性:
        • Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: SH-SY5Y (KO PDGFRA), Lane 3: C6, Lane 4: NIH/3T3
        • Immunofluorescent analysis of SH-SY5Y cells using F3240 (green, 1:500), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
        規(guī)格 價(jià)格 庫(kù)存 購(gòu)買數(shù)量
        20uL 790 現(xiàn)貨
        50uL 1240 現(xiàn)貨
        100uL 1990 現(xiàn)貨
        100uL*2 3790 現(xiàn)貨

        400-668-6834

        [email protected]

        操作要點(diǎn)

        WB
        建議 SDS-PAGE 分離膠濃度:5%

        使用信息

        稀釋比例
        1:1000
        1:30
        0.26 µg/Ml (Human, Rat) - 1:500(Mouse)
        1:500
        1:50
        抗體應(yīng)用
        WB, IP, IHC, IF, FCM, ELISA
        反應(yīng)性
        Human, Mouse, Rat
        抗體類型
        Rabbit Monoclonal Antibody
        儲(chǔ)存液配方
        PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?
        儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
        -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
        預(yù)測(cè)分子量
        實(shí)際分子量
        122 kDa
        150 kDa, 180 kDa
        *為什么預(yù)測(cè)分子量和實(shí)際分子量會(huì)有不同?
        以下原因可能會(huì)導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測(cè)不同:翻譯后修飾(磷酸化/糖基化);剪接變體和異構(gòu)體;相對(duì)電荷;多聚體。

        實(shí)驗(yàn)方法

        WB
        實(shí)驗(yàn)步驟:
         
        樣品制備
        1. 組織樣品:破碎組織,加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),低溫勻漿。
        2. 貼壁細(xì)胞樣品:吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),冰上靜置裂解 5 min。
        3. 懸浮細(xì)胞樣品:將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心,棄上清,用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),冰上靜置裂解 5 min。
        4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min,收集上清液;
        5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;
        6. 加入蛋白上樣緩沖液,將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min,冰上靜置冷卻后離心 5 min。
         
        電泳分離
        1. 根據(jù)所提蛋白的濃度,將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠(即下層膠)濃度:5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表
        2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V,觀察 Marker,待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后,即可停止電泳。(注意電泳時(shí)電流切勿過大,如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升,容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流,可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。)
         
        轉(zhuǎn)膜
        1.拿出電轉(zhuǎn)槽,把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中;
        2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗;
        3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好;
        4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。(推薦采用 0.45 µm PVDF 膜) PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表
        濕轉(zhuǎn)法參考條件:200 mA, 120 min
        (注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié),分子量大的蛋白適宜采用大電流,并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間,但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中,避免凝膠融化。)
         
        封閉
        1. 電轉(zhuǎn)移后,室溫下用 TBST 洗膜 5 min;
        2. 在封閉液中將膜孵育 1 h,室溫;
        3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
         
        抗體孵育
        1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液(建議一抗稀釋比 1:1000),4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜;
        2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
        3. 在封閉液中加入二抗,室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h;
        4. 孵育結(jié)束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
         
        顯色
        1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物(或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì))混合均勻;
        2. 與膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜濕潤(rùn)),置于顯影儀中進(jìn)行曝光。
         
        IF
        實(shí)驗(yàn)步驟:
         
        標(biāo)本制備
        1. 吸出液體,然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細(xì)胞至 2-3 mm 的深度。
        注意:多聚甲醛有毒,只能在通風(fēng)櫥中使用。
        2. 室溫固定細(xì)胞 15 分鐘。
        3. 吸出固定液,用 1X PBS 沖洗 3 次,每次 5 分鐘。
        4. 繼續(xù)進(jìn)行免疫染色。
         
        免疫染色
        1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。
        2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。
        3. 吸出封閉液,加入制備好的一抗稀釋液。
        4. 4°C 孵育過夜。
        5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次,每次 5 分鐘。
        6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中,室溫避光孵育 1-2 小時(shí)。
        7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次,每次 5 分鐘。
        8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。
        9. 為獲得最佳效果,請(qǐng)讓封固劑在室溫下固化過夜。 如需長(zhǎng)期保存,請(qǐng)將載玻片平放在 32°C 避光保存。
         
        IF
        實(shí)驗(yàn)步驟:
        樣品準(zhǔn)備
        1. 貼壁細(xì)胞:取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。
        2. 懸浮細(xì)胞:將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。
        3. 冰凍切片:將玻片置于室溫下解凍,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。
        4. 石蠟切片:先將玻片脫蠟至水,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。
         
        固定
        1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        通透
        1. 對(duì)樣品添加去垢劑,如 0.1~0.3% Triton X-100,室溫通透 10~20 min。
        (僅針對(duì)胞內(nèi)抗原,若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。)
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        封閉
        添加封閉液,在室溫下封閉至少 1 h。(常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。)
        注意事項(xiàng):從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn),避免干燥,否則極易產(chǎn)生高背景。
         
        免疫熒光染色(第一天)
        1. 吸走封閉液,滴加稀釋后的一抗。
        2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。
         
        免疫熒光染色(第二天)
        1. 吸走一抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        2. 滴加稀釋后的熒光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
        3. 吸走二抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        4. 滴加稀釋后的 DAPI,室溫避光 孵育 5~10 min。
        5. PBST 中搖洗 3 次,每次 5 分鐘。
         
        封片
        1. 抗熒光淬滅封片劑封片。
        2. 干燥玻片,將玻片置于室溫下避光過夜。
        3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
         
        IHC
        實(shí)驗(yàn)步驟:
         
        脫蠟/補(bǔ)液
        1. 脫蠟/水合切片:
        2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次,每次 5 分鐘。
        3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次,每次 10 分鐘。
        4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次,每次 10 分鐘。
        5. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        6.抗原修復(fù):對(duì)于檸檬酸鹽:將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中,在微波爐中加熱,直至開始沸騰; 在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。 在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。
         
        染色
        1. 用 dH2O 清洗切片 3 次,每次 5 分鐘。
        2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。
        3. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。
        5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。
        6. 除去封閉液,并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。
        7. 去除抗體溶液,用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次,每次 5 分鐘。
        8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。 在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。
        9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次,每次 5 分鐘。
        10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。
        11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。
        12. 將載玻片浸入 dH2O 中。
        13. 如果需要,用蘇木精復(fù)染切片。
        14. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        15. 切片脫水:95%乙醇孵育切片兩次,每次 10 秒; 在 100% 乙醇中重復(fù),孵育切片兩次,每次 10 秒; 在二甲苯中重復(fù),孵育切片兩次,每次 10 秒。
        16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。
         

        Datasheet & SDS

        生物描述

        特異性

        PDGFR α Antibody [P1E17] 可識(shí)別內(nèi)源性總 PDGFR α 蛋白水平。

        蛋白定位
        細(xì)胞膜,高爾基體,內(nèi)膜系統(tǒng)
        Uniprot ID
        P16234
        克隆號(hào)
        P1E17
        別名
        Platelet-derived growth factor receptor alpha; PDGF-R-alpha; PDGFR-alpha; Alpha platelet-derived growth factor receptor; Alpha-type platelet-derived growth factor receptor
        背景
        Platelet-derived growth factor receptor alpha(血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α,PDGFRα)是一種III型受體酪氨酸激酶,其特征是具有五個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單一的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)含有分裂的激酶結(jié)構(gòu)域、一個(gè)獨(dú)特的插入序列、一個(gè)靠近膜的結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可變的C端尾部的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。通過配體誘導(dǎo)的二聚化和自磷酸化激活,PDGFRα在結(jié)合PDGF配體(不包括PDGF-D)時(shí)形成同源或異源二聚體(例如,與PDGFRβ)。PDGFRα主要在顱神經(jīng)嵴(CNC)衍生的間充質(zhì)中表達(dá),并且對(duì)于胚胎發(fā)育至關(guān)重要,特別是顱面和牙齒形態(tài)發(fā)生。它以旁分泌方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和遷移,PDGFRα在牙源性間充質(zhì)中表達(dá),其配體PDGF-A在牙齒發(fā)育的所有階段的牙釉質(zhì)中表達(dá)。PDGFRα功能喪失會(huì)導(dǎo)致顱面缺陷、中面部裂隙和胚胎致死性,強(qiáng)調(diào)了其在CNC衍生組織發(fā)育中的關(guān)鍵作用。
        參考文獻(xiàn)
        • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23906712/
        • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15543606/

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