PE MHC Class I/H-2Db Antibody [28-14-8]

組織樣本或細(xì)胞樣本準(zhǔn)備:
1. 待檢測的組織樣本（如脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓等）用細(xì)胞染色緩沖液制成單細(xì)胞懸液。如果檢測樣本是體外刺激的細(xì)胞，將刺激后的細(xì)胞用細(xì)胞染色緩沖液重懸，然后進(jìn)行第2步；
2. 用細(xì)胞染色緩沖液將總體積補(bǔ)充至約15 mL，350g離心5分鐘，棄去上清液。

裂解紅細(xì)胞:
3. 需要裂解紅細(xì)胞的組織（例如脾臟），用3 mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，冰上裂解5分鐘；
注意：紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液不同調(diào)整用量及時間；
4. 加入10 mL細(xì)胞染色緩沖液終止裂解。350g離心5分鐘，棄去上清液；
5. 重復(fù)步驟2的洗滌操作；
6. 對活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，用細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5–10×10? cells/mL，將細(xì)胞懸液以每管100 μL（每管含5–10×10?個細(xì)胞）的量分裝到12×75 mm的流式管中。

封閉Fc受體:
封閉Fc受體有助于減少非特異性免疫熒光染色。
7. 對于小鼠樣品，建議使用對FcγR III/II具有特異性的抗小鼠CD16/32抗體。在100 μL體系中，每10?個細(xì)胞加入0.25 μg抗小鼠CD16/32抗體，冰上預(yù)孵育5–10分鐘；
8. 對于人源樣品，可在每100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL人Fc受體封閉液，室溫孵育5–10分鐘。若無有效/可用的封閉抗體，可用與免疫熒光染色所用抗體同種屬、同型別的過量無關(guān)純化Ig封閉細(xì)胞。

使用抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色:
9. 按預(yù)先確定的最佳濃度加入熒光偶聯(lián)抗體、生物素偶聯(lián)抗體或純化的一抗（例如抗CD3-FITC、抗CD4-Biotin和抗CD8-APC），冰上避光孵育15–20分鐘；
10. 用至少2 mL細(xì)胞染色緩沖液洗滌2次，以350g離心5分鐘；
11. 如果使用純化的一抗，則將沉淀用殘留緩沖液重懸，并加入預(yù)先確定的最佳濃度的抗種屬免疫球蛋白熒光偶聯(lián)二抗（例如FITC標(biāo)記的抗小鼠Ig），冰上避光孵育15–20分鐘；
12. 重復(fù)步驟10；
13. 用0.5 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并加入5 μL（0.25 μg）/百萬個細(xì)胞的7-AAD活力染色溶液排除死細(xì)胞；注意避免光譜重疊；
14. 冰上避光孵育3–5分鐘；
15. 進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選（FACS）或流式細(xì)胞術(shù)分析。

注意：如果您無法立即上機(jī)檢測，請將樣品避光并置于4–8℃的冰箱中，樣品應(yīng)重懸于細(xì)胞染色緩沖液中。請注意，不要將樣品長時間放置于固定緩沖液中，因為這會影響熒光基團(tuán)構(gòu)象和熒光強(qiáng)度。

固定
1. 如果染色細(xì)胞內(nèi)抗原，首先按細(xì)胞表面流式細(xì)胞術(shù)染色方案操作進(jìn)行細(xì)胞表面抗原染色。然后，每管加入0.5 mL固定緩沖液，室溫避光固定20分鐘。
2. 350g離心5分鐘，棄去上清液；
注意：胞內(nèi)染色通常在表面染色后進(jìn)行，以避免固定/破膜步驟破壞表面抗原表位。

破膜
3. 將固定后的細(xì)胞重懸于胞內(nèi)染色破膜洗滌緩沖液，350g離心5–10分鐘；
4. 重復(fù)步驟3兩次。

胞內(nèi)染色
5. 將固定/破膜后的細(xì)胞重懸于殘留的少量胞內(nèi)染色破膜洗滌緩沖液中，加入預(yù)先確定的最佳濃度的目標(biāo)熒光偶聯(lián)抗體（例如：PE標(biāo)記的抗IFN-γ抗體）或相應(yīng)的陰性對照抗體。室溫避光孵育20分鐘；
6. 用2 mL胞內(nèi)染色破膜洗滌緩沖液洗滌，350g離心5分鐘。洗滌兩次；
7. 若胞內(nèi)一抗是生物素化的，需要進(jìn)行熒光偶聯(lián)鏈霉親和素孵育。用胞內(nèi)染色破膜洗滌緩沖液洗滌；
8. 將固定并完成胞內(nèi)染色的細(xì)胞重懸于0.5 mL細(xì)胞染色緩沖液中，使用適當(dāng)?shù)膶φ战M上機(jī)分析。

注意：為確認(rèn)抗細(xì)胞因子染色的特異性，推薦進(jìn)行阻斷實驗。細(xì)胞固定/破膜后，先與過量未標(biāo)記的抗細(xì)胞因子抗體預(yù)孵育。或先將重組的目標(biāo)細(xì)胞因子與熒光偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體預(yù)孵育，再將此混合物加入細(xì)胞。

全血樣本的活化與胞內(nèi)染色
1. 將肝素化全血與無菌的組織培養(yǎng)液按1:1比例稀釋；
2. 此階段可進(jìn)行抗原或有絲分裂原介導(dǎo)的體外細(xì)胞刺激。如需染色胞內(nèi)細(xì)胞因子或趨化因子（例如：IFN-γ或IL-4），必須加入高效的蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，如布雷菲德菌素A（brefeldin A）或莫能菌素（monensin）。加入合適的細(xì)胞活化劑后，將200 μL全血細(xì)胞懸液分裝至12×75 mm塑料管中，在37°C、5% CO?條件下孵育4–6小時；
3. 加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育5–10分鐘；
4. 350g離心5分鐘，棄去上清液；
5. 用細(xì)胞染色緩沖液洗滌細(xì)胞1次。按細(xì)胞表面流式細(xì)胞術(shù)染色方案進(jìn)行細(xì)胞表面免疫熒光染色；
6. 按上述第一部分（固定）、第二部分（破膜）和第三部分（胞內(nèi)染色）的步驟進(jìn)行細(xì)胞的固定、破膜和胞內(nèi)抗原染色。

細(xì)胞表面流式細(xì)胞術(shù)染色
1. 待染色細(xì)胞用細(xì)胞染色緩沖液重懸，用細(xì)胞染色緩沖液將總體積補(bǔ)充至約15 mL，350g離心5分鐘，棄去上清液。
2. 對活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，用細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5–10×10? cells/mL，將細(xì)胞懸液以每管100 μL（每管含5–10×10?個細(xì)胞）的量分裝到12×75 mm的流式管中。

封閉Fc受體:
封閉Fc受體有助于減少非特異性免疫熒光染色。

使用抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色:
3. 按預(yù)先確定的最佳濃度加入熒光偶聯(lián)抗體、生物素偶聯(lián)抗體或純化的一抗，冰上避光孵育15–20分鐘；
4. 用至少2 mL細(xì)胞染色緩沖液洗滌2次，以350g離心5分鐘。

使用抗體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子染色:
5. 最后一次洗滌后，棄上清，輕柔渦旋樣品以分散細(xì)胞沉淀。
6. 每個孔中加入200 μL（微孔板）或1 mL（5 mL管）細(xì)胞固定液，輕柔吹打以確保細(xì)胞完全重懸。室溫避光孵育45–60分鐘。
7. 室溫下300–400g離心5分鐘，棄去上清液。輕柔渦旋震蕩以分散細(xì)胞沉淀。
8. 每孔加入200 μL（微孔板）或2 mL（5 mL管）破膜緩沖液。
9. 室溫下300–400g離心5分鐘，棄去上清液。輕柔渦旋震蕩以分散細(xì)胞沉淀。
10. 重復(fù)步驟8–9兩次。總共使用破膜緩沖液進(jìn)行3次洗滌。
11. 適量體積破膜緩沖液重懸細(xì)胞，每孔加入適量用破膜緩沖液稀釋的熒光偶聯(lián)抗體，室溫避光孵育至少30分鐘。
12. 每孔加入200 μL或2 mL（5 mL管）破膜緩沖液。
13. 室溫下300–400g離心5分鐘，棄去上清液。輕柔渦旋震蕩以分散細(xì)胞沉淀。
14. 重復(fù)步驟12–13兩次。總共使用破膜緩沖液進(jìn)行3次洗滌。
15. 適量體積的細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。