Phospho-4E-BP1 (Thr70) Antibody [K18C18]

目錄號: F0851

抗體應用：反應性：Human, Monkey

Lane 1: HeLa (serum starved)
Lane 2: HeLa (serum starved; Insulin, 1 μM, 30 min)
Lane 3: HeLa (serum starved; Insulin and λ phosphatase-treated)

規(guī)格	價格	庫存
20ul	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100ul	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

客戶使用該產(chǎn)品的實驗數(shù)據(jù)

操作要點

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：20%。
濕轉參考條件：200 mA, 60 min，建議使用 0.22 μm PVDF膜。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:50

抗體應用
WB, IP

反應性
Human, Monkey

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預測分子量
15-20 kDa

陽性對照	Hela (serum starved); Hela (serum starved; insulin-treated, 1 μM, 30 min)
陰性對照	HeLa (λ phosphatase-treated)

樣品處理數(shù)據(jù)示例

樣品	處理情況
Hela	Serum starvation
Hela	Serum starvation + Insulin treatment (1 μM, 30 min)
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^*該蛋白在不同的人源細胞、組織內(nèi)的表達量預測請參考：http://www.proteinatlas.org

樣品	處理情況

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：20 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉膜 1.拿出電轉槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉法參考條件：200 mA, 60 min。（注意電轉條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉膜時間，但需要確保電轉槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：20 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉膜

1.拿出電轉槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉法參考條件：200 mA, 60 min。

（注意電轉條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉膜時間，但需要確保電轉槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

IF
實驗步驟：標本制備 1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細胞至 2-3 mm 的深度。注意：多聚甲醛有毒，只能在通風櫥中使用。 2. 室溫固定細胞 15 分鐘。 3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。 4. 繼續(xù)進行免疫染色。免疫染色 1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。 2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。 3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。 4. 4°C 孵育過夜。 5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。 6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時。 7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。 8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。 9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。如需長期保存，請將載玻片平放在 4°C 避光保存。

實驗步驟：

標本制備

1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細胞至 2-3 mm 的深度。

注意：多聚甲醛有毒，只能在通風櫥中使用。

2. 室溫固定細胞 15 分鐘。

3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

4. 繼續(xù)進行免疫染色。

免疫染色

1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。

2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。

3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。

4. 4°C 孵育過夜。

5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時。

7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。

8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。

9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。如需長期保存，請將載玻片平放在 4°C 避光保存。

IHC
實驗步驟：脫蠟/補液 1. 脫蠟/水合切片： 2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。 3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。 4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。 5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 6.抗原修復：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。 2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。 3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。 5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個切片 1 小時。 6. 除去封閉液，并向每個切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。 7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。 9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。 11. 在每個切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強度。 12. 將載玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用蘇木精復染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復，孵育切片兩次，每次 10 秒。 16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

IHC

實驗步驟：

脫蠟/補液

1. 脫蠟/水合切片：

2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。

3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。

4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。

5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

6.抗原修復：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。

5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個切片 1 小時。

6. 除去封閉液，并向每個切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。

7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。

9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。

11. 在每個切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強度。

12. 將載玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用蘇木精復染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復，孵育切片兩次，每次 10 秒。

16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Phospho-4E-BP1 (Thr70) Antibody [K18C18] 僅識別 Ser70 處磷酸化的內(nèi)源性 4E-BP1 蛋白水平。

蛋白定位
細胞質(zhì)，細胞核

Uniprot ID
Q13541

克隆號
K18C18

背景
翻譯抑制蛋白 4E-BP1（也稱為 PHAS-1）通過與翻譯起始因子 eIF4E 結合來抑制帽子依賴性翻譯而發(fā)揮作用。這種相互作用在 4E-BP1 過度磷酸化時被破壞，導致帽依賴性翻譯的激活。 4E-BP1 的活性受 PI3 激酶/Akt 通路和 FRAP/mTOR 激酶的調(diào)節(jié)。在體內(nèi)，4E-BP1 的多個殘基發(fā)生磷酸化。雖然 FRAP/mTOR 在 Thr37 和 Thr46 處的磷酸化不會阻礙 4E-BP1 與 eIF4E 的結合，但據(jù)信為隨后在 Ser65 和 Thr70 處的磷酸化準備了 4E-BP1。

背景

翻譯抑制蛋白 4E-BP1（也稱為 PHAS-1）通過與翻譯起始因子 eIF4E 結合來抑制帽子依賴性翻譯而發(fā)揮作用。這種相互作用在 4E-BP1 過度磷酸化時被破壞，導致帽依賴性翻譯的激活。 4E-BP1 的活性受 PI3 激酶/Akt 通路和 FRAP/mTOR 激酶的調(diào)節(jié)。在體內(nèi)，4E-BP1 的多個殘基發(fā)生磷酸化。雖然 FRAP/mTOR 在 Thr37 和 Thr46 處的磷酸化不會阻礙 4E-BP1 與 eIF4E 的結合，但據(jù)信為隨后在 Ser65 和 Thr70 處的磷酸化準備了 4E-BP1。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9204908/ [2] Gingras AC, et al. Genes Dev. 1999 Jun 1;13(11):1422-37.

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%