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Phospho-Akt1 (Ser473) Antibody [K10L8]
目錄號: F4087
抗體應(yīng)用：
反應(yīng)性：
-
Lane 1: LNCap -
Immunofluorescent analysis of MEF cells using F4087 (green, 1:200), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
客戶使用該產(chǎn)品的實驗數(shù)據(jù)
使用信息
| 稀釋比例 |
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| 抗體應(yīng)用 |
|---|
| WB, IP, IF, FCM |
| 反應(yīng)性 |
|---|
| Human, Mouse, Rat |
| 抗體類型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 儲存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 |
| 儲存條件(自收到貨起) |
|---|
| -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
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預(yù)測分子量
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|---|
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60 kDa
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實驗方法
| WB |
|---|
實驗步驟： 樣品制備
1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；
6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。
電泳分離
1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）
轉(zhuǎn)膜
1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；
3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表 濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。
（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）
封閉
1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗體孵育 1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；
4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
顯色
1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；
2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。
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| IF |
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實驗步驟：
標(biāo)本制備
1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細(xì)胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通風(fēng)櫥中使用。
2. 室溫固定細(xì)胞 15 分鐘。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
4. 繼續(xù)進(jìn)行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。
2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。
3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。
4. 4°C 孵育過夜。
5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時。
7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。
9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。 如需長期保存，請將載玻片平放在 23°C 避光保存。
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| IF |
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實驗步驟：
樣品準(zhǔn)備
1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片。
2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。
3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。
4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。
通透
1. 對樣品添加去垢劑，如 0.1~0.3% Triton X-100，室溫通透 10~20 min。
（僅針對胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。）
2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。
封閉
添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。
免疫熒光染色（第一天）
1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。
2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。
免疫熒光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。
封片
1. 抗熒光淬滅封片劑封片。
2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。
3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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生物描述
| 特異性 |
|---|
| Phospho-Akt1 (Ser473) Antibody [K10L8] 僅識別 Ser473 處磷酸化的內(nèi)源性 Akt1 蛋白水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)膜系統(tǒng)，線粒體，細(xì)胞核 |
| Uniprot ID |
|---|
| P31749 |
| 克隆號 |
|---|
| K10L8 |
| 別名 |
|---|
| RAC-alpha serine/threonine-protein kinase; Protein kinase B (PKB); Protein kinase B alpha (PKB alpha); Proto-oncogene c-Akt; RAC-PK-alpha; AKT1; PKB; RAC |
| 背景 |
|---|
| 磷酸化 Akt1 (Ser473) 是絲氨酸/蘇氨酸激酶 Akt1 的關(guān)鍵活化形式，而 Akt1 是 PI3K/Akt 信號通路的重要組成部分。該通路調(diào)控關(guān)鍵的細(xì)胞過程，例如生長、存活、代謝和增殖。Akt1 包含一個用于膜定位的普萊克底物蛋白同源性 (PH) 結(jié)構(gòu)域、一個激酶結(jié)構(gòu)域和一個位于 Ser473 處的 C 端疏水基序。在生長因子刺激下，Akt1 被募集到膜上，并通過 PDK1 在 Thr308 位點的磷酸化而部分激活。完全激活需要 mTORC2 復(fù)合物在 Ser473 位點進(jìn)行額外的磷酸化。這第二次磷酸化增強(qiáng)了 Akt1 的激酶活性并擴(kuò)大了其底物特異性。 Ser473位點的磷酸化會誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而緩解PH結(jié)構(gòu)域的自身抑制作用，使Akt1能夠有效地磷酸化參與細(xì)胞周期進(jìn)程、代謝和存活的下游靶標(biāo)。Thr308位點的磷酸化是Akt1發(fā)揮功能所必需的，而Ser473位點的磷酸化則能夠微調(diào)其活性，并與癌癥的耐藥性相關(guān)。mTORC2和其他因子對該位點的調(diào)控支持持續(xù)的增殖和抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 |
| 參考文獻(xiàn) |
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