Phospho-FoxO1 (Ser256) Antibody [E12L24]

目錄號(hào): F0800

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse, Rat, Monkey

Lane 1: C2C12 (Insulin, 100 nM, 15 min), Lane 2: C2C12 (LY294002, 50 μM, 2 h)

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

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客戶使用該產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

操作要點(diǎn)

制樣過(guò)程中除蛋白酶抑制劑，建議額外使用磷酸酶抑制劑。
建議進(jìn)行翻譯后修飾FoxO1蛋白檢測(cè)的同時(shí)，也同步量化總FoxO1蛋白水平，以排除假陰性結(jié)果。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:50

抗體應(yīng)用
WB, IP

反應(yīng)性
Human, Mouse, Rat, Monkey

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
82 kDa

陽(yáng)性對(duì)照	293T; C2C12 (insulin, 100 nM, 15 min)
陰性對(duì)照	293T (phosphatase-treated)

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Phospho-FoxO1 (Ser256) Antibody [E12L24] 僅識(shí)別 Ser256 處磷酸化的內(nèi)源性 FoxO1 蛋白水平。該抗體與在 Ser193 位點(diǎn)磷酸化的過(guò)表達(dá) FoxO4 發(fā)生交叉反應(yīng)，也可能與在 Ser253 位點(diǎn)磷酸化的過(guò)表達(dá) FoxO3a 發(fā)生交叉反應(yīng)。該抗體還會(huì)與約 160kD 的未知來(lái)源蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

特異性

Phospho-FoxO1 (Ser256) Antibody [E12L24] 僅識(shí)別 Ser256 處磷酸化的內(nèi)源性 FoxO1 蛋白水平。該抗體與在 Ser193 位點(diǎn)磷酸化的過(guò)表達(dá) FoxO4 發(fā)生交叉反應(yīng)，也可能與在 Ser253 位點(diǎn)磷酸化的過(guò)表達(dá) FoxO3a 發(fā)生交叉反應(yīng)。該抗體還會(huì)與約 160kD 的未知來(lái)源蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

蛋白定位
細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核

Uniprot ID
Q12778

克隆號(hào)
E12L24

別名
FOXO1A (phospho S256),Phospho-FoxO1 (Ser256)

背景
FOXO1 又稱 FKHR（橫紋肌肉瘤中的叉頭轉(zhuǎn)錄因子），是叉頭轉(zhuǎn)錄因子 O 類 (FoxO) 亞家族的成員。人類中的該家族還包括 FOXO3a、FOXO4 和 FOXO6。FOXO1 最初是通過(guò)與人類肺泡橫紋肌肉瘤 (ARMS) 中的 PAX3 和 PAX7 基因融合而發(fā)現(xiàn)的。FOXO1 蛋白由四個(gè)調(diào)控其活性的關(guān)鍵功能域組成：高度保守的叉頭 (FKH) 域，也稱為 DNA 結(jié)合域 (DBD)、DBD COOH 末端堿性區(qū)域中的核定位信號(hào) (NLS)、位于 DBD 下游的核輸出序列 (NES) 和 COOH 末端轉(zhuǎn)錄激活域 (TAD)。作為 FoxO 家族的創(chuàng)始成員，F(xiàn)OXO1 與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥和糖尿病。 Akt 通過(guò)對(duì) Thr24、Ser256 和 Ser319 位點(diǎn)的叉頭轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化，使其失活，導(dǎo)致其核輸出和轉(zhuǎn)錄活性的抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加。

背景

FOXO1 又稱 FKHR（橫紋肌肉瘤中的叉頭轉(zhuǎn)錄因子），是叉頭轉(zhuǎn)錄因子 O 類 (FoxO) 亞家族的成員。人類中的該家族還包括 FOXO3a、FOXO4 和 FOXO6。FOXO1 最初是通過(guò)與人類肺泡橫紋肌肉瘤 (ARMS) 中的 PAX3 和 PAX7 基因融合而發(fā)現(xiàn)的。FOXO1 蛋白由四個(gè)調(diào)控其活性的關(guān)鍵功能域組成：高度保守的叉頭 (FKH) 域，也稱為 DNA 結(jié)合域 (DBD)、DBD COOH 末端堿性區(qū)域中的核定位信號(hào) (NLS)、位于 DBD 下游的核輸出序列 (NES) 和 COOH 末端轉(zhuǎn)錄激活域 (TAD)。作為 FoxO 家族的創(chuàng)始成員，F(xiàn)OXO1 與多種人類疾病有關(guān)，包括癌癥和糖尿病。 Akt 通過(guò)對(duì) Thr24、Ser256 和 Ser319 位點(diǎn)的叉頭轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化，使其失活，導(dǎo)致其核輸出和轉(zhuǎn)錄活性的抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21443466/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15149589/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%