Phospho-Smad3 (Ser423/Ser425) Antibody [L3N2]

目錄號(hào): F2846

本抗體識(shí)別磷酸化的Smad3（Ser 423/425），也能檢測(cè)到磷酸化的Smad1 (Ser 463/465)、Smad2 (Ser 465/467)和Smad5 (Ser 463/465)。

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse

Lane 1: A549, Lane 2: A549 (TGF-?1, 5ng/ml, 24h), Lane 3: A549 (TGF-?1, 5ng/ml, 24h; alkaline phosphatase treated)
Immunofluorescent analysis of A549 cells using F2846 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價(jià)格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

本抗體識(shí)別磷酸化的Smad3（Ser 423/425），也能檢測(cè)到磷酸化的Smad1 (Ser 463/465)、Smad2 (Ser 465/467)和Smad5 (Ser 463/465)。

使用信息

稀釋比例
WB1:2000 IHC1:200 IF1:100

抗體應(yīng)用
WB, IHC, IF

反應(yīng)性
Human, Mouse

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
48 kDa

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:2000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:2000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Phospho-Smad3 (Ser423/Ser425) Antibody [L3N2] 用于檢測(cè)當(dāng) Ser 423/425 位點(diǎn)磷酸化時(shí)內(nèi)源性 Phospho-Smad3 (Ser 423/Ser 425) 總的蛋白水平。該 Smad3 抗體還可以檢測(cè)在等效位點(diǎn)磷酸化的 Smad1、Smad2 和 Smad5。

蛋白定位
細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核

克隆號(hào)
L3N2

別名
Phospho-Smad3 (Ser 423/425)+Smad5 (Ser 463/465)+Smad1 (Ser 463/465)+Smad2 (Ser 465/467)

背景
Phospho-Smad3 (Ser 423/Ser 425)是Smad3在其C端的兩個(gè)關(guān)鍵絲氨酸殘基的磷酸化形式，對(duì)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。在TGF-β激活后，I型受體激酶（TβRI）在Ser 423和Ser 425位點(diǎn)磷酸化Smad3，誘導(dǎo)構(gòu)象變化，使其與受體復(fù)合物分離。這一磷酸化事件使Smad3與Smad4形成異源復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)參與細(xì)胞過程的靶基因的轉(zhuǎn)錄，如增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)。Ser 423/Ser 425的磷酸化增強(qiáng)了Smad3的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，使其能夠與共激活因子如CBP和p300相互作用，精確調(diào)節(jié)基因表達(dá)。磷酸化Smad3的失調(diào)會(huì)通過改變TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)態(tài)，導(dǎo)致如纖維化、免疫障礙和腫瘤進(jìn)展等病理狀況。

背景

Phospho-Smad3 (Ser 423/Ser 425)是Smad3在其C端的兩個(gè)關(guān)鍵絲氨酸殘基的磷酸化形式，對(duì)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。在TGF-β激活后，I型受體激酶（TβRI）在Ser 423和Ser 425位點(diǎn)磷酸化Smad3，誘導(dǎo)構(gòu)象變化，使其與受體復(fù)合物分離。這一磷酸化事件使Smad3與Smad4形成異源復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)參與細(xì)胞過程的靶基因的轉(zhuǎn)錄，如增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)。Ser 423/Ser 425的磷酸化增強(qiáng)了Smad3的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，使其能夠與共激活因子如CBP和p300相互作用，精確調(diào)節(jié)基因表達(dá)。磷酸化Smad3的失調(diào)會(huì)通過改變TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)態(tài)，導(dǎo)致如纖維化、免疫障礙和腫瘤進(jìn)展等病理狀況。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19458083/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%