Phospho-YAP (Ser397) Antibody [B23M8]

目錄號(hào): F0753

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: HepG2, Lane 2: SW480, Lane 3: MDA-MB-435, Lane 4: MDA-MB-453

規(guī)格	價(jià)格	庫(kù)存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:100

抗體應(yīng)用
WB, IP

反應(yīng)性
Human, Mouse, Rat

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測(cè)分子量
65 kDa-78 kDa

陽(yáng)性對(duì)照	Hep G2 cells; MDA-MB-231 cell (treated with epinephrine (10 μM, 60 min) or Forskolin (10 μm, 60 min)); MDA-MB-453 cell; SW480 cell; F9 cell
陰性對(duì)照

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大，如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液（建議使用 5% BSA溶液）中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤(rùn)），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Phospho-YAP (Ser397) Antibody [B23M8] 僅識(shí)別 Ser397 處磷酸化的內(nèi)源性 YAP 總蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞連接，細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)膜系統(tǒng)，細(xì)胞核，細(xì)胞緊密連接

Uniprot ID
P46937

克隆號(hào)
B23M8

別名
Hippo; P-YAP; S347; S381; Ser347; Ser381; YAP S381; Yorkie

背景
pYAP-Ser397（Ser397位點(diǎn)磷酸化 YAP）是 Yes 相關(guān)蛋白 (YAP) 的磷酸化形式，YAP 是 Hippo 信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共激活因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、干細(xì)胞更新和組織生長(zhǎng)。激酶 LATS1/2 對(duì) S397 位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，產(chǎn)生磷酸化降解決定子基序，該基序有利于 β-TrCP E3 泛素連接酶的識(shí)別，導(dǎo)致 YAP 在蛋白酶體中降解，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。這種翻譯后修飾在限制 YAP 的核定位和阻止 TEAD 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活方面起著關(guān)鍵作用，而 TEAD 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)程、存活和致癌轉(zhuǎn)化。相反，由磷酸酶（例如PP1A）介導(dǎo)的S397位點(diǎn)去磷酸化，可以穩(wěn)定YAP并促進(jìn)其在細(xì)胞核中積累，從而驅(qū)動(dòng)促生長(zhǎng)基因（例如Myc、細(xì)胞周期蛋白E和Rheb）的轉(zhuǎn)錄，尤其是在增殖的祖細(xì)胞中。值得注意的是，S397磷酸化不僅受LATS激酶調(diào)控，還通過(guò)LATS非依賴性通路（例如整合素α3/FAK/CDC42軸）調(diào)控，該通路調(diào)節(jié)PP1A活性以促進(jìn)YAP-S397去磷酸化。因此，pYAP-S397充當(dāng)平衡YAP穩(wěn)定性和定位的分子開(kāi)關(guān)，其調(diào)控對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)、支持干細(xì)胞動(dòng)力學(xué)以及防止過(guò)度增殖或腫瘤形成至關(guān)重要。

背景

pYAP-Ser397（Ser397位點(diǎn)磷酸化 YAP）是 Yes 相關(guān)蛋白 (YAP) 的磷酸化形式，YAP 是 Hippo 信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄共激活因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、干細(xì)胞更新和組織生長(zhǎng)。激酶 LATS1/2 對(duì) S397 位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，產(chǎn)生磷酸化降解決定子基序，該基序有利于 β-TrCP E3 泛素連接酶的識(shí)別，導(dǎo)致 YAP 在蛋白酶體中降解，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。這種翻譯后修飾在限制 YAP 的核定位和阻止 TEAD 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活方面起著關(guān)鍵作用，而 TEAD 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)程、存活和致癌轉(zhuǎn)化。相反，由磷酸酶（例如PP1A）介導(dǎo)的S397位點(diǎn)去磷酸化，可以穩(wěn)定YAP并促進(jìn)其在細(xì)胞核中積累，從而驅(qū)動(dòng)促生長(zhǎng)基因（例如Myc、細(xì)胞周期蛋白E和Rheb）的轉(zhuǎn)錄，尤其是在增殖的祖細(xì)胞中。值得注意的是，S397磷酸化不僅受LATS激酶調(diào)控，還通過(guò)LATS非依賴性通路（例如整合素α3/FAK/CDC42軸）調(diào)控，該通路調(diào)節(jié)PP1A活性以促進(jìn)YAP-S397去磷酸化。因此，pYAP-S397充當(dāng)平衡YAP穩(wěn)定性和定位的分子開(kāi)關(guān)，其調(diào)控對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)、支持干細(xì)胞動(dòng)力學(xué)以及防止過(guò)度增殖或腫瘤形成至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28457749/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27979972/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%