Phospho-Zyxin (Ser142/143) Antibody [L24L6]

目錄號: F1478

抗體應用：反應性：Human, Mouse, Rat, Monkey, Dog

Lane 1: A-431
Lane 2: A-431 (λ/CIP treated)
Lane 3: U-2 OS
Lane 4: U-2 OS (λ/CIP treated)

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點

WB
建議曝光 90s 以上。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:200

抗體應用
WB, IP

反應性
Human, Mouse, Rat, Monkey, Dog

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預測分子量
78 kDa

陽性對照	A-431; U-2 OS
陰性對照	A-431 (treated with λ and calf intestinal phosphatase); U-2 OS (treated with λ and calf intestinal phosphatase)

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。 (建議曝光時長 90s 以上)。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail, 磷酸酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。 (建議曝光時長 90s 以上)。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
Phospho-Zyxin (Ser142/143) Antibody [L24L6] 用于檢測當Ser 142/143 位點磷酸化時內(nèi)源性 Zyxin 總的蛋白水平。

蛋白定位
細胞連接，細胞質(zhì)，細胞骨架，細胞核

Uniprot ID
Q15942

克隆號
L24L6

背景
Phospho-Zyxin (Ser 142/143) 是 zyxin 的磷酸化形式，zyxin 是一種機械敏感的 LIM 結(jié)構(gòu)域黏著斑蛋白，對肌動蛋白細胞骨架組織和細胞信號傳導至關(guān)重要。它在各種細胞類型中表達，特別是內(nèi)皮細胞和肌肉細胞，其在絲氨酸殘基 142 和 143 處的磷酸化（由 PKA 等激酶介導）增強了其與肌動蛋白絲和黏著斑成分的相互作用。從結(jié)構(gòu)上看，zyxin 包括富含脯氨酸的 ActA 區(qū)域、LIM 結(jié)構(gòu)域和包含這些磷酸化位點的 N 端區(qū)域，這些位點可誘導構(gòu)象變化來調(diào)控其功能。磷酸化 zyxin 在內(nèi)皮細胞胞吐中起著至關(guān)重要的作用，特別是在血管性血友病因子分泌以維持血管完整性以及肌動蛋白細胞骨架重塑中起著重要作用，這對于細胞形狀、運動性和機械穩(wěn)定性至關(guān)重要。這些磷酸化事件對于整合細胞外信號和調(diào)控細胞骨架動力學至關(guān)重要，使得磷酸化 zyxin 在血管生物學和細胞反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

背景

Phospho-Zyxin (Ser 142/143) 是 zyxin 的磷酸化形式，zyxin 是一種機械敏感的 LIM 結(jié)構(gòu)域黏著斑蛋白，對肌動蛋白細胞骨架組織和細胞信號傳導至關(guān)重要。它在各種細胞類型中表達，特別是內(nèi)皮細胞和肌肉細胞，其在絲氨酸殘基 142 和 143 處的磷酸化（由 PKA 等激酶介導）增強了其與肌動蛋白絲和黏著斑成分的相互作用。從結(jié)構(gòu)上看，zyxin 包括富含脯氨酸的 ActA 區(qū)域、LIM 結(jié)構(gòu)域和包含這些磷酸化位點的 N 端區(qū)域，這些位點可誘導構(gòu)象變化來調(diào)控其功能。磷酸化 zyxin 在內(nèi)皮細胞胞吐中起著至關(guān)重要的作用，特別是在血管性血友病因子分泌以維持血管完整性以及肌動蛋白細胞骨架重塑中起著重要作用，這對于細胞形狀、運動性和機械穩(wěn)定性至關(guān)重要。這些磷酸化事件對于整合細胞外信號和調(diào)控細胞骨架動力學至關(guān)重要，使得磷酸化 zyxin 在血管生物學和細胞反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33572997/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28256511/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%