RNF40 Antibody [D22C8]

目錄號: F1352

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human

Lane 1: HCT 116
Lane 2: DLD-1
Lane 3: MCF7
Lane 4: OVCAR8
Lane 5: A172
Lane 6: Hela
Lane 7: DU145
Lane 8: HPB-ALL
Lane 9: A-375
Lane 10: RH30

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:100

抗體應(yīng)用
WB, IP

反應(yīng)性
Human

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量
130 kDa

陽性對照	HCT 116; DLD-1; MCF7; OVCAR8; A172; HPB-ALL; DU145; Hela; A-375; RH30; 293T
陰性對照

樣品處理數(shù)據(jù)示例

樣品	處理情況
293T	Tansfection (hRNF20-Myc/DDK)
293T	Tansfection (hRNF40-Myc/DDK)
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^*該蛋白在不同的人源細胞、組織內(nèi)的表達量預(yù)測請參考：http://www.proteinatlas.org

樣品	處理情況

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
RNF40 Antibody [D22C8] 識別內(nèi)源性RNF40總蛋白水平。該抗體與RNF20/BRE1A無交叉反應(yīng)。

蛋白定位
細胞核

Uniprot ID
O75150

克隆號
D22C8

背景
RNF40 是一種環(huán)指 E3 泛素連接酶，具有多個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和一個 C 端環(huán)指基序，參與蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。它編碼一種 1001 個氨基酸的多肽，質(zhì)量為 113,678 Da。RNF40 與其旁系同源物 RNF20 形成穩(wěn)定的異二聚體，后者在賴氨酸 120 處對組蛋白 H2B 和其他非組蛋白進行單泛素化。RNF40 既是腫瘤抑制因子又是致癌基因，在癌癥的發(fā)展、進展和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。RNF40 位于染色體 16p11.2 上，在人類和大鼠組織中普遍表達。它對于賴氨酸 120 (H2Bub1) 處的組蛋白 2B 單泛素化至關(guān)重要，影響正常乳腺組織和基底樣乳腺癌 (BLBC) 中的干細胞特性。 RNF40 在結(jié)直腸癌中具有抗凋亡和促炎作用，并通過抑制細胞凋亡和促進 HER2+ 乳腺癌中的黏著斑激酶 (FAK) 活性來維持腫瘤。

背景

RNF40 是一種環(huán)指 E3 泛素連接酶，具有多個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和一個 C 端環(huán)指基序，參與蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。它編碼一種 1001 個氨基酸的多肽，質(zhì)量為 113,678 Da。RNF40 與其旁系同源物 RNF20 形成穩(wěn)定的異二聚體，后者在賴氨酸 120 處對組蛋白 H2B 和其他非組蛋白進行單泛素化。RNF40 既是腫瘤抑制因子又是致癌基因，在癌癥的發(fā)展、進展和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。RNF40 位于染色體 16p11.2 上，在人類和大鼠組織中普遍表達。它對于賴氨酸 120 (H2Bub1) 處的組蛋白 2B 單泛素化至關(guān)重要，影響正常乳腺組織和基底樣乳腺癌 (BLBC) 中的干細胞特性。 RNF40 在結(jié)直腸癌中具有抗凋亡和促炎作用，并通過抑制細胞凋亡和促進 HER2+ 乳腺癌中的黏著斑激酶 (FAK) 活性來維持腫瘤。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33199825/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37770435/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%