• <dfn id="q240u"></dfn>
    • SF3B1 Antibody [G23D1]

      目錄號(hào): F2976

        抗體應(yīng)用: 反應(yīng)性:
        • Lane 1: RAW 264.7, Lane 2: PC-12, Lane 3: NIH/3T3, Lane 4: C6
        • Immunofluorescent analysis of Hela cells using F2976 (green, 1:200), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
        規(guī)格 價(jià)格 庫存 購買數(shù)量
        20uL 790 現(xiàn)貨
        50uL 1240 現(xiàn)貨
        100uL 1990 現(xiàn)貨
        100uL*2 3790 現(xiàn)貨

        400-668-6834

        [email protected]

        操作要點(diǎn)

        WB
        建議 SDS-PAGE 分離膠濃度:5%

        使用信息

        稀釋比例
        1:1000-1:10000
        1:100
        1:250
        1:2000
        抗體應(yīng)用
        WB, IHC, IF, FCM
        反應(yīng)性
        Human, Mouse, Rat
        抗體類型
        Rabbit Monoclonal Antibody
        儲(chǔ)存液配方
        PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?
        儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
        -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
        預(yù)測分子量
        146 kDa
        陽性對照 Human colon; Human glioma; HeLa; Jurkat; K562; Ramos; SF3B1; RAW 264.7 (nuclear fraction); PC-12; NIH/3T3; C6
        陰性對照 RAW 264.7 (cytoplasmic fraction)

        實(shí)驗(yàn)方法

        WB
        實(shí)驗(yàn)步驟:
         
        樣品制備
        1. 組織樣品:破碎組織,加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品,靜置30 min。
        2. 貼壁細(xì)胞樣品:吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),超聲破碎,冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。
        3. 懸浮細(xì)胞樣品:將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心,棄上清,用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),冰上靜置裂解 5 min。
        4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min,收集上清液;
        5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度;
        6. 加入蛋白上樣緩沖液,將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min,冰上靜置冷卻后離心 5 min。
         
        電泳分離
        1. 根據(jù)所提蛋白的濃度,將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠(即下層膠)濃度:5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表
        2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V,觀察 Marker,待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后,即可停止電泳。(注意電泳時(shí)電流切勿過大,如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升,容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流,可對電泳槽使用冰浴降溫。)
         
        轉(zhuǎn)膜
        1.拿出電轉(zhuǎn)槽,把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中;
        2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗;
        3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好;
        4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。(推薦采用 0.45 µm PVDF 膜) PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表
        濕轉(zhuǎn)法參考條件:200 mA, 120 min
        (注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié),分子量大的蛋白適宜采用大電流,并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間,但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中,避免凝膠融化。)
         
        封閉
        1. 電轉(zhuǎn)移后,室溫下用 TBST 洗膜 5 min;
        2. 在封閉液中將膜孵育 1 h,室溫;
        3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
         
        抗體孵育
        1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液(建議一抗稀釋比 1:1000),4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜;
        2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
        3. 在封閉液中加入二抗,室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h;
        4. 孵育結(jié)束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
         
        顯色
        1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物(或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì))混合均勻;
        2. 與膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜濕潤),置于顯影儀中進(jìn)行曝光。
         
        IF
        實(shí)驗(yàn)步驟:
        樣品準(zhǔn)備
        1. 貼壁細(xì)胞:取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片。
        2. 懸浮細(xì)胞:將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。
        3. 冰凍切片:將玻片置于室溫下解凍,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。
        4. 石蠟切片:先將玻片脫蠟至水,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。
         
        固定
        1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        通透
        1. 對樣品添加去垢劑,如 0.1~0.3% Triton X-100,室溫通透 10~20 min。
        (僅針對胞內(nèi)抗原,若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。)
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        封閉
        添加封閉液,在室溫下封閉至少 1 h。(常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。)
        注意事項(xiàng):從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤,避免干燥,否則極易產(chǎn)生高背景。
         
        免疫熒光染色(第一天)
        1. 吸走封閉液,滴加稀釋后的一抗。
        2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。
         
        免疫熒光染色(第二天)
        1. 吸走一抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        2. 滴加稀釋后的熒光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
        3. 吸走二抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        4. 滴加稀釋后的 DAPI,室溫避光 孵育 5~10 min。
        5. PBST 中搖洗 3 次,每次 5 分鐘。
         
        封片
        1. 抗熒光淬滅封片劑封片。
        2. 干燥玻片,將玻片置于室溫下避光過夜。
        3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
         
        IHC
        實(shí)驗(yàn)步驟:
         
        脫蠟/補(bǔ)液
        1. 脫蠟/水合切片:
        2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次,每次 5 分鐘。
        3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次,每次 10 分鐘。
        4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次,每次 10 分鐘。
        5. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        6.抗原修復(fù):對于檸檬酸鹽:將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中,在微波爐中加熱,直至開始沸騰; 在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。 在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。
         
        染色
        1. 用 dH2O 清洗切片 3 次,每次 5 分鐘。
        2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。
        3. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。
        5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。
        6. 除去封閉液,并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。
        7. 去除抗體溶液,用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次,每次 5 分鐘。
        8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。 在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。
        9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次,每次 5 分鐘。
        10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。
        11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。
        12. 將載玻片浸入 dH2O 中。
        13. 如果需要,用蘇木精復(fù)染切片。
        14. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        15. 切片脫水:95%乙醇孵育切片兩次,每次 10 秒; 在 100% 乙醇中重復(fù),孵育切片兩次,每次 10 秒; 在二甲苯中重復(fù),孵育切片兩次,每次 10 秒。
        16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。
         
        IF

        實(shí)驗(yàn)步驟:

        樣品準(zhǔn)備
        1. 貼壁細(xì)胞:取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片。
        2. 懸浮細(xì)胞:將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。
        3. 冰凍切片:將玻片置于室溫下解凍,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。
        4. 石蠟切片:先將玻片脫蠟至水,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。
         
        固定
        1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        通透
        1. 對樣品添加去垢劑,如 0.1~0.3% Triton X-100,室溫通透 10~20 min。
        (僅針對胞內(nèi)抗原,若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。)
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        封閉
        添加封閉液,在室溫下封閉至少 1 h。(常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。)
        注意事項(xiàng):從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤,避免干燥,否則極易產(chǎn)生高背景。
         
        免疫熒光染色(第一天)
        1. 吸走封閉液,滴加稀釋后的一抗。
        2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。
         
        免疫熒光染色(第二天)
        1. 吸走一抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        2. 滴加稀釋后的熒光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
        3. 吸走二抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        4. 滴加稀釋后的 DAPI,室溫避光 孵育 5~10 min。
        5. PBST 中搖洗 3 次,每次 5 分鐘。
         
        封片
        1. 抗熒光淬滅封片劑封片。
        2. 干燥玻片,將玻片置于室溫下避光過夜。
        3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

        Datasheet & SDS

        生物描述

        特異性

        SF3B1 Antibody [G23D1] 用于檢測內(nèi)源性 SF3B1 總的蛋白水平。

        蛋白定位
        細(xì)胞核,剪切小體
        Uniprot ID
        O75533,Q7Z497,A0JLT9 (NA)
        克隆號(hào)
        G23D1
        背景

        SF3B1(剪接因子 3B 亞基 1)是剪接體的關(guān)鍵組成部分,剪接體是負(fù)責(zé)在 RNA 剪接過程中從前 mRNA 中去除內(nèi)含子的細(xì)胞機(jī)制。從結(jié)構(gòu)上講,SF3B1 是 U2 小核核糖核蛋白 (snRNP) 復(fù)合物的一部分,并含有促進(jìn)剪接體組裝所必需的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的 HEAT 重復(fù)序列。它在識(shí)別分支點(diǎn)序列和穩(wěn)定剪接體、確保準(zhǔn)確剪接以及實(shí)現(xiàn)可變剪接以產(chǎn)生不同的 mRNA 亞型方面起著關(guān)鍵作用。SF3B1 激活是剪接體組裝中的關(guān)鍵事件,它與其他剪接因子協(xié)作來調(diào)控前 mRNA 加工。SF3B1 對于確保基因表達(dá)的完整性和促進(jìn)蛋白質(zhì)多樣性至關(guān)重要,這對正常細(xì)胞功能至關(guān)重要。SF3B1 突變存在于慢性淋巴細(xì)胞白血病 (CLL)、骨髓增生異常綜合征 (MDS) 和葡萄膜黑色素瘤等癌癥中。這些突變會(huì)導(dǎo)致異常的剪接模式,包括內(nèi)含子保留和基因表達(dá)失調(diào),從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。它們通常會(huì)影響 HEAT 域并與不良預(yù)后有關(guān)。SF3B1 對 RNA 剪接、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和影響疾病進(jìn)展至關(guān)重要,尤其是在癌癥中。

        參考文獻(xiàn)
        • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38846999/
        • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32905346/

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