SHIP2 Antibody [C21E14]

目錄號: F1964

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human

Lane 1: OVCAR8, Lane 2: LN18, Lane 3: HeLa
Immunofluorescent analysis of Hela cells using F1964 (green, 1:25), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:50 IF1:25 FCM1:50

抗體應(yīng)用
WB, IP, IF, FCM

反應(yīng)性
Human

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲存條件(自收到貨起)
–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量
160 kDa

陽性對照	OVCAR8; LN18; HeLa
陰性對照

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

IF
實驗步驟：樣品準(zhǔn)備 1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片。 2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。 3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。 4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復(fù)。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。封閉添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。免疫熒光染色（第一天） 1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。 2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。免疫熒光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。封片 1. 抗熒光淬滅封片劑封片。 2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。 3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

實驗步驟：

樣品準(zhǔn)備

1. 貼壁細(xì)胞：取潔凈無菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片。

2. 懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無菌載玻片上。

3. 冰凍切片：將玻片置于室溫下解凍，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。

4. 石蠟切片：先將玻片脫蠟至水，純水或 PBS 搖洗 3次，每次 3 min。然后進行抗原修復(fù)。

固定

1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。

2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次，每次 3 min。

封閉

添加封閉液，在室溫下封閉至少 1 h。（常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或山羊血清。）

注意事項：從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤，避免干燥，否則極易產(chǎn)生高背景。

免疫熒光染色（第一天）

1. 吸走封閉液，滴加稀釋后的一抗。

2. 濕盒中 4°C 孵育過夜。

免疫熒光染色（第二天）

1. 吸走一抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

2. 滴加稀釋后的熒光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。

3. 吸走二抗，PBST 搖洗 3 次，每次 5 min。

4. 滴加稀釋后的 DAPI，室溫避光孵育 5~10 min。

5. PBST 中搖洗 3 次，每次 5 分鐘。

封片

1. 抗熒光淬滅封片劑封片。

2. 干燥玻片，將玻片置于室溫下避光過夜。

3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
SHIP2 Antibody [C21E14] 可檢測內(nèi)源性總 SHIP2 的蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜，細(xì)胞突起，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞骨架，內(nèi)膜，細(xì)胞核

Uniprot ID
O15357

克隆號
C21E14

背景
SHIP2 是一種磷酸酶，專門作用于磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸的 5 位。SHIP1 是一種相關(guān)的胞漿磷酸酶，其 N 端具有 SH2 結(jié)構(gòu)域，C 端具有兩個 NPXY Shc 結(jié)合基序。受體交聯(lián)后，SHIP 通過將其 SH2 結(jié)構(gòu)域與 ITIM 基序中的磷酸酪氨酸結(jié)合而被募集到膜連接處，隨后在 NPXY 基序上進行酪氨酸磷酸化。SHIP2 是負(fù)責(zé)磷酸肌醇或肌醇磷酸 5 位去磷酸化的幾種酶之一。它與影響骨骼發(fā)育的疾病 opsismodysplasia 有關(guān)，并與參與胰島素信號傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架組織和免疫系統(tǒng)功能的蛋白質(zhì)相互作用。SHIP2 的可逆磷酸化對于其與其他蛋白質(zhì)的相互作用、其在磷酸肌醇信號傳導(dǎo)中的作用及其催化活性至關(guān)重要。 SHIP2 在細(xì)胞黏附和擴散中也發(fā)揮重要作用，這可能是通過其與 p130Cas 銜接蛋白（也稱為乳腺癌抗雌激素抗性蛋白 1）的相互作用實現(xiàn)的。該蛋白介導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架組織，并通過其 SH2 結(jié)構(gòu)域與磷酸化的 SHIP2 結(jié)合。SHIP2 是 SHIP1 的同源物，主要在心臟、骨骼肌和胎盤中表達。在某些細(xì)胞類型中，降低 INPPL1 表達或抑制 SHIP2 活性已被證明會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

背景

SHIP2 是一種磷酸酶，專門作用于磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸的 5 位。SHIP1 是一種相關(guān)的胞漿磷酸酶，其 N 端具有 SH2 結(jié)構(gòu)域，C 端具有兩個 NPXY Shc 結(jié)合基序。受體交聯(lián)后，SHIP 通過將其 SH2 結(jié)構(gòu)域與 ITIM 基序中的磷酸酪氨酸結(jié)合而被募集到膜連接處，隨后在 NPXY 基序上進行酪氨酸磷酸化。SHIP2 是負(fù)責(zé)磷酸肌醇或肌醇磷酸 5 位去磷酸化的幾種酶之一。它與影響骨骼發(fā)育的疾病 opsismodysplasia 有關(guān)，并與參與胰島素信號傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架組織和免疫系統(tǒng)功能的蛋白質(zhì)相互作用。SHIP2 的可逆磷酸化對于其與其他蛋白質(zhì)的相互作用、其在磷酸肌醇信號傳導(dǎo)中的作用及其催化活性至關(guān)重要。 SHIP2 在細(xì)胞黏附和擴散中也發(fā)揮重要作用，這可能是通過其與 p130Cas 銜接蛋白（也稱為乳腺癌抗雌激素抗性蛋白 1）的相互作用實現(xiàn)的。該蛋白介導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架組織，并通過其 SH2 結(jié)構(gòu)域與磷酸化的 SHIP2 結(jié)合。SHIP2 是 SHIP1 的同源物，主要在心臟、骨骼肌和胎盤中表達。在某些細(xì)胞類型中，降低 INPPL1 表達或抑制 SHIP2 活性已被證明會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27907247/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%