SIRT5 Antibody [G24H6]

目錄號: F3785

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse, Rat

Lane 1: HepG2, Lane 2: Huh7, Lane 3: Mouse heart, Lane 4: Rat heart

規(guī)格	價格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

使用信息

稀釋比例
WB1:1000 IP1:30 IHC1:100 FCM1:50

抗體應(yīng)用
WB, IP, IHC, FCM

反應(yīng)性
Human, Mouse, Rat

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

儲存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量實際分子量
33 kDa 30 kDa
^*為什么預(yù)測分子量和實際分子量會有不同？以下原因可能會導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對電荷；多聚體。

陽性對照	Mouse liver; Mouse heart; Rat liver; Rat heart; Human liver; Human heart; Human ovarian adenocarcinoma; HepG2; Huh7
陰性對照

實驗方法

WB
實驗步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。 2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

實驗步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿。

2. 貼壁細胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進行曝光。

IHC
實驗步驟：脫蠟/補液 1. 脫蠟/水合切片： 2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。 3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。 4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。 5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 6.抗原修復(fù)：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。 2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。 3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。 5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個切片 1 小時。 6. 除去封閉液，并向每個切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。 7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。 9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。 11. 在每個切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強度。 12. 將載玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。 16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

IHC

實驗步驟：

脫蠟/補液

1. 脫蠟/水合切片：

2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。

3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。

4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。

5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

6.抗原修復(fù)：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。

5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個切片 1 小時。

6. 除去封閉液，并向每個切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。

7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。

9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。

11. 在每個切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強度。

12. 將載玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。

16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
SIRT5 Antibody [G24H6] 可檢測內(nèi)源性 SIRT5 總蛋白水平。

蛋白定位
細胞質(zhì)，線粒體，細胞核

Uniprot ID
Q9NXA8

克隆號
G24H6

別名
SIR2L5, SIRT5, Regulatory protein SIR2 homolog 5, SIR2-like protein 5.

背景
SIRT5 是一個重要的調(diào)節(jié)因子，參與多種生理功能，包括細胞分化、凋亡、代謝、衰老、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激控制和線粒體活性。由于其廣泛的影響力，SIRT5 已成為多種相關(guān)疾病的有希望的治療靶點。值得注意的是，SIRT5 在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮雙重作用。在非小細胞肺癌 (NSCLC) 中，其表達模式具有環(huán)境依賴性：高 SIRT5 水平，加上 SUN2 抑制，可促進癌細胞增殖；相反，NSCLC 中 SIRT5 表達降低會導(dǎo)致 STAT3 乙酰化增強，從而促進 ATP 生成并支持腫瘤生長。人類 Sirt5 基因位于 6p3 染色體上，編碼四種蛋白質(zhì)異構(gòu)體——SIRT5?iso1、SIRT5?iso2、SIRT5?iso3 和 SIRT5?iso4，每種蛋白質(zhì)的分子量約為 34 kDa。 SIRT5?iso1–3 亞型主要定位于線粒體，而 SIRT5?iso4 主要存在于細胞質(zhì)中。雖然 Sirt5 基因在人體組織中廣泛表達，但亞型的分布各不相同。SIRT5?iso1 在幾乎所有人體組織中都有表達，脂肪、膀胱和氣管除外，其中腦和腎臟表達最為豐富。SIRT5?iso2 在腦中最常見，在其他組織中較少發(fā)現(xiàn)。SIRT5?iso3−4 主要在腦和腎臟中表達。從結(jié)構(gòu)上講，SIRT5 具有獨特的特性，可以實現(xiàn)選擇性底物靶向。其脫酰酶活性可特異性地從肽鏈中去除乙酰基、琥珀酰基、丙二酰基和戊二酰基，從而調(diào)節(jié)一系列代謝和調(diào)控途徑。

背景

SIRT5 是一個重要的調(diào)節(jié)因子，參與多種生理功能，包括細胞分化、凋亡、代謝、衰老、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激控制和線粒體活性。由于其廣泛的影響力，SIRT5 已成為多種相關(guān)疾病的有希望的治療靶點。值得注意的是，SIRT5 在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮雙重作用。在非小細胞肺癌 (NSCLC) 中，其表達模式具有環(huán)境依賴性：高 SIRT5 水平，加上 SUN2 抑制，可促進癌細胞增殖；相反，NSCLC 中 SIRT5 表達降低會導(dǎo)致 STAT3 乙酰化增強，從而促進 ATP 生成并支持腫瘤生長。人類 Sirt5 基因位于 6p3 染色體上，編碼四種蛋白質(zhì)異構(gòu)體——SIRT5?iso1、SIRT5?iso2、SIRT5?iso3 和 SIRT5?iso4，每種蛋白質(zhì)的分子量約為 34 kDa。 SIRT5?iso1–3 亞型主要定位于線粒體，而 SIRT5?iso4 主要存在于細胞質(zhì)中。雖然 Sirt5 基因在人體組織中廣泛表達，但亞型的分布各不相同。SIRT5?iso1 在幾乎所有人體組織中都有表達，脂肪、膀胱和氣管除外，其中腦和腎臟表達最為豐富。SIRT5?iso2 在腦中最常見，在其他組織中較少發(fā)現(xiàn)。SIRT5?iso3−4 主要在腦和腎臟中表達。從結(jié)構(gòu)上講，SIRT5 具有獨特的特性，可以實現(xiàn)選擇性底物靶向。其脫酰酶活性可特異性地從肽鏈中去除乙酰基、琥珀酰基、丙二酰基和戊二酰基，從而調(diào)節(jié)一系列代謝和調(diào)控途徑。

參考文獻
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39979670/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

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* 必填項

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%