VAV2 Antibody [B11L17]

目錄號(hào): F2348

抗體應(yīng)用：反應(yīng)性：Human, Mouse

Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (KO VAV2)
Lane 3: 293

規(guī)格	價(jià)格	庫存
20uL	790	現(xiàn)貨
50uL	1240	現(xiàn)貨
100uL	1990	現(xiàn)貨
100uL*2	3790	現(xiàn)貨
400-668-6834 [email protected]

操作要點(diǎn)

WB
建議 SDS-PAGE 分離膠濃度：5%。
建議一抗稀釋比: 1:20000

使用信息

稀釋比例
WB1:20000 IP1:50 IHC1:50 - 1:100 FCM1:2500

抗體應(yīng)用
WB, IP, IHC, FCM

反應(yīng)性
Human, Mouse

抗體類型
Rabbit Monoclonal Antibody

儲(chǔ)存液配方
PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?

儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

預(yù)測分子量
101 kDa

陽性對(duì)照	Human cervical carcinoma; HeLa; 293; HAP1
陰性對(duì)照

實(shí)驗(yàn)方法

WB
實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備 1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。 2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。 3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。 4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度； 6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。電泳分離 1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表 2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）轉(zhuǎn)膜 1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗； 3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好； 4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）封閉 1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗體孵育 1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:20000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h； 4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。顯色 1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻； 2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

樣品制備

1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。

2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。

3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。

4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；

6. 加入蛋白上樣緩沖液，將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min，冰上靜置冷卻后離心 5 min。

電泳分離

1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：5 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表

2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。）

轉(zhuǎn)膜

1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；

3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；

4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表

濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 120 min。

（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）

封閉

1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗體孵育

1. 用一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:20000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；

4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

顯色

1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；

2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。

IHC
實(shí)驗(yàn)步驟：脫蠟/補(bǔ)液 1. 脫蠟/水合切片： 2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。 3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。 4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。 5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。 2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。 3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。 5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。 6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。 7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。 9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。 10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。 11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。 12. 將載玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。 15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。 16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

IHC

實(shí)驗(yàn)步驟：

脫蠟/補(bǔ)液

1. 脫蠟/水合切片：

2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。

3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。

4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。

5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

6.抗原修復(fù)：對(duì)于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰；在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。

染色

1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。

3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。

5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。

6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。

7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。

9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。

10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。

11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。

12. 將載玻片浸入 dH2O 中。

13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。

14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。

15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒；在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。

16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

Datasheet & SDS

生物描述

特異性
VAV2 Antibody [B11L17] 用于檢測內(nèi)源性 VAV2 總的蛋白水平。

蛋白定位
細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)

Uniprot ID
P52735

克隆號(hào)
B11L17

背景
Vav2 是鳥嘌呤核苷酸交換因子 (GEF) Vav 家族的重要成員，在激活 Rho GTPases（如 Rho、Rac 和 Cdc42）中起著至關(guān)重要的作用，這些酶對(duì)于調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞過程至關(guān)重要。從結(jié)構(gòu)上講，Vav2 由多個(gè)域組成，這些域使其具有廣泛的功能，包括負(fù)責(zé)激活 GTPases 的 Dbl 同源性 (DH) 域、促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的 Src 同源性 3 (SH3) 域以及參與膜定位和細(xì)胞靶向的 pleckstrin 同源性 (PH) 域。Vav2 在免疫應(yīng)答中尤其重要，尤其是在 T 細(xì)胞中，其對(duì) Rho GTPases 的激活促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，這對(duì)于 T 細(xì)胞活化、遷移和細(xì)胞因子產(chǎn)生至關(guān)重要，從而支持免疫系統(tǒng)對(duì)感染作出反應(yīng)的能力。它通過調(diào)控樹突棘（突觸的重要結(jié)構(gòu)）的發(fā)育來幫助突觸可塑性，并在記憶形成和神經(jīng)可塑性中發(fā)揮作用。 Vav2 還控制血管張力和平滑肌收縮，這對(duì)于維持血壓和血管健康至關(guān)重要。 Vav2 活性失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌癥，其中異常信號(hào)傳導(dǎo)可驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。在心血管疾病中， Vav2 的異常激活會(huì)導(dǎo)致高血壓和血管功能障礙的發(fā)展。

背景

Vav2 是鳥嘌呤核苷酸交換因子 (GEF) Vav 家族的重要成員，在激活 Rho GTPases（如 Rho、Rac 和 Cdc42）中起著至關(guān)重要的作用，這些酶對(duì)于調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞過程至關(guān)重要。從結(jié)構(gòu)上講，Vav2 由多個(gè)域組成，這些域使其具有廣泛的功能，包括負(fù)責(zé)激活 GTPases 的 Dbl 同源性 (DH) 域、促進(jìn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的 Src 同源性 3 (SH3) 域以及參與膜定位和細(xì)胞靶向的 pleckstrin 同源性 (PH) 域。Vav2 在免疫應(yīng)答中尤其重要，尤其是在 T 細(xì)胞中，其對(duì) Rho GTPases 的激活促進(jìn)了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，這對(duì)于 T 細(xì)胞活化、遷移和細(xì)胞因子產(chǎn)生至關(guān)重要，從而支持免疫系統(tǒng)對(duì)感染作出反應(yīng)的能力。它通過調(diào)控樹突棘（突觸的重要結(jié)構(gòu)）的發(fā)育來幫助突觸可塑性，并在記憶形成和神經(jīng)可塑性中發(fā)揮作用。 Vav2 還控制血管張力和平滑肌收縮，這對(duì)于維持血壓和血管健康至關(guān)重要。 Vav2 活性失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌癥，其中異常信號(hào)傳導(dǎo)可驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。在心血管疾病中， Vav2 的異常激活會(huì)導(dǎo)致高血壓和血管功能障礙的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31100928/ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34571735/

PVDF膜孔徑規(guī)格選擇參照表

Protein Size (kDa)	PVDF Transfer Membrane Pore Size (μm)
< 10	0.22
10-20	0.22
20-30	0.45
30-45	0.45
45-70	0.45
80-100	0.45
100-140	0.45
> 140	0.45

技術(shù)支持

在訂購、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用我們的產(chǎn)品的任何階段，您遇到的任何問題，均可以通過撥打我們的熱線電話400-668-6834，或者技術(shù)支持郵箱[email protected]，直接聯(lián)系到我們。我們會(huì)在24小時(shí)內(nèi)盡快聯(lián)系您。

* 必填項(xiàng)

Protein Size (kDa)	Separating Gel Percentage
4-40	20%
12-45	15%
10-70	12.5%
15-100	10%
25-100	8%
60-210	5%