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xCT/SLC7A11 Antibody [E20L8]
目錄號: F0517
進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，不建議對xCT/SLC7A11膜蛋白樣品進(jìn)行高溫煮樣操作。
抗體應(yīng)用：
反應(yīng)性：
-
Lane 1: Huh7
Lane 2: Hep G2
客戶使用Selleck的xCT/SLC7A11 Antibody [E20L8]發(fā)表文獻(xiàn)4篇
客戶使用該產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
操作要點(diǎn)
WB
濕轉(zhuǎn)參考條件：200 mA, 60 min。
請勿煮樣，煮樣易造成后續(xù)無法檢測到條帶、條帶背景較深、位置不對或拖尾嚴(yán)重。
使用信息
| 稀釋比例 |
|---|
|
| 抗體應(yīng)用 |
|---|
| WB, IP |
| 反應(yīng)性 |
|---|
| Human |
| 抗體類型 |
|---|
| Rabbit Monoclonal Antibody |
| 儲存液配方 |
|---|
| PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN? |
| 儲存條件(自收到貨起) |
|---|
| –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years |
|
預(yù)測分子量
實(shí)際分子量
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|---|
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55 kDa
35 kDa
|
| *為什么預(yù)測分子量和實(shí)際分子量會有不同？ 以下原因可能會導(dǎo)致蛋白分子量與預(yù)測不同：翻譯后修飾（磷酸化/糖基化）；剪接變體和異構(gòu)體；相對電荷；多聚體。 |
| 陽性對照 | Human brain (PMID:29350434); Human lung carcinoma; A549; Huh7; Hep G2 |
|---|---|
| 陰性對照 | Human skeletal muscle (PMID: 17401668); Human lung, heart, kidney and liver (PMID: 22667998); COLO 205 (PMID: 31000598); 293T |
樣品處理數(shù)據(jù)示例
| 樣品 | 處理情況 |
| 293T | Vector transfection (human xCT/SLC7A5) |
| 點(diǎn)擊查看更多樣品數(shù)據(jù) | |
*該蛋白在不同的人源細(xì)胞、組織內(nèi)的表達(dá)量預(yù)測請參考：http://www.proteinatlas.org
實(shí)驗(yàn)方法
| WB |
|---|
實(shí)驗(yàn)步驟：
樣品制備
1. 組織樣品：破碎組織，加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品，靜置30 min。
2. 貼壁細(xì)胞樣品：吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），超聲破碎，冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。
3. 懸浮細(xì)胞樣品：將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心，棄上清，用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制劑Cocktail），冰上靜置裂解 5 min。
4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液測定蛋白質(zhì)濃度；
6. 在 20 μL 樣品中加入蛋白上樣緩沖液，可直接冰上備用；或通過溫度梯度（如37 ℃煮樣、50 ℃煮樣、70 ℃煮樣、90 ℃煮樣、100 ℃煮樣）來確定最佳變性條件，冰上靜置冷卻后離心 5 min。
電泳分離
1. 根據(jù)所提蛋白的濃度，將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠（即下層膠）濃度：10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表
2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V，觀察 Marker，待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后，即可停止電泳。（注意電泳時(shí)電流切勿過大，如超過 150 mA 會導(dǎo)致溫度上升，容易影響跑膠結(jié)果。如無法避免采用大電流，可對電泳槽使用冰浴降溫。）
轉(zhuǎn)膜
1.拿出電轉(zhuǎn)槽，把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗；
3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好；
4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。（推薦采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表
濕轉(zhuǎn)法參考條件：200 mA, 60 min。
（注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié)，分子量大的蛋白適宜采用大電流，并延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間，但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中，避免凝膠融化。）
封閉
1. 電轉(zhuǎn)移后，室溫下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封閉液中將膜孵育 1 h，室溫；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗體孵育
1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液（建議一抗稀釋比 1:1000），4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封閉液中加入二抗，室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h；
4. 孵育結(jié)束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
顯色
1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物（或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì)）混合均勻；
2. 與膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜濕潤），置于顯影儀中進(jìn)行曝光。
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| IF |
|---|
實(shí)驗(yàn)步驟：
標(biāo)本制備
1. 吸出液體，然后用 1X PBS 稀釋的 4% 多聚甲醛覆蓋細(xì)胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通風(fēng)櫥中使用。
2. 室溫固定細(xì)胞 15 分鐘。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
4. 繼續(xù)進(jìn)行免疫染色。
免疫染色
1. 添加封閉緩沖液并在室溫下孵育 60 分鐘。
2. 按照建議在抗體稀釋緩沖液中制備一抗稀釋液。
3. 吸出封閉液，加入制備好的一抗稀釋液。
4. 4°C 孵育過夜。
5. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
6. 將樣本放入用抗體稀釋緩沖液稀釋的熒光染料偶聯(lián)二抗中，室溫避光孵育 1-2 小時(shí)。
7. 在 1X PBS 中沖洗 3 次，每次 5 分鐘。
8. 使用帶有 DAPI 的封固劑封固載玻片并蓋上蓋玻片。
9. 為獲得最佳效果，請讓封固劑在室溫下固化過夜。 如需長期保存，請將載玻片平放在 4°C 避光保存。
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| IHC |
|---|
實(shí)驗(yàn)步驟：
脫蠟/補(bǔ)液
1. 脫蠟/水合切片：
2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分鐘。
3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 分鐘。
4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次，每次 10 分鐘。
5. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
6.抗原修復(fù)：對于檸檬酸鹽：將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中，在微波爐中加熱，直至開始沸騰； 在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。 在工作臺上冷卻玻片 30 分鐘。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分鐘。
2. 將切片在 3% 過氧化氫中孵育 10 分鐘。
3. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。
5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。
6. 除去封閉液，并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過夜。
7. 去除抗體溶液，用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。 在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。
9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次，每次 5 分鐘。
10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。
11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。
12. 將載玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用蘇木精復(fù)染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片兩次，每次 5 分鐘。
15. 切片脫水：95%乙醇孵育切片兩次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒； 在二甲苯中重復(fù)，孵育切片兩次，每次 10 秒。
16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。
|
生物描述
| 特異性 |
|---|
xCT/SLC7A11 Antibody [E20L8] 可識別 xCT/SLC7A11 總蛋白的內(nèi)源水平。 |
| 蛋白定位 |
|---|
| 細(xì)胞膜，細(xì)胞突起，內(nèi)膜 |
| Uniprot ID |
|---|
| Q9UPY5 |
| 克隆號 |
|---|
| E20L8 |
| 別名 |
|---|
| xCT,SLC7A11 |
| 背景 |
|---|
胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SLC7A11，也稱為 xCT，促進(jìn)胱氨酸輸入以進(jìn)行谷胱甘肽合成和抗氧化防御。 它在許多癌癥中過度表達(dá)，通過抑制鐵死亡（一種脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡）來促進(jìn)腫瘤生長。 xc− 系統(tǒng)是一種不依賴于鈉的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以 1:1 的比例輸出細(xì)胞內(nèi)谷氨酸，同時(shí)輸入細(xì)胞外胱氨酸。 包含兩個(gè)亞基，包括通過二硫鍵連接的重鏈 SLC3A2 (CD98) 和輕鏈 SLC7A11 (xCT)。 SLC7A11 是一種多次跨膜蛋白，介導(dǎo)胱氨酸/谷氨酸交換，而 SLC3A2 是一種單跨膜蛋白，充當(dāng)伴侶，維持 SLC7A11 的穩(wěn)定性和正確的膜定位。 |
| 參考文獻(xiàn) |
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