• <dfn id="q240u"></dfn>
    • YAP Antibody [C6K11]

      目錄號(hào): F0366

        如需獲取不同樣本的表達(dá)情況請(qǐng)點(diǎn)擊“樣品處理數(shù)據(jù)示例表”。

        抗體應(yīng)用: 反應(yīng)性:
        • Lane 1: A-204, Lane 2: SK-OV-3, Lane 3: A549, Lane 4: MCF7
        • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human Urothelial Carcinoma tissue with F0366 at 1/100 dilution.
        • Immunofluorescent analysis of HT-29 cells using F0366 (green, 1:50), Hoechst (blue) and tubulin (Red).
        1/
        規(guī)格 價(jià)格 庫(kù)存 購(gòu)買數(shù)量
        20uL 790 現(xiàn)貨
        50uL 1240 現(xiàn)貨
        100uL 1990 現(xiàn)貨
        100uL*2 3790 現(xiàn)貨

        400-668-6834

        [email protected]

        客戶使用該產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

        使用信息

        稀釋比例
        1:1000
        1:50
        1:200 - 1:800
        1:50 - 1:200
        1:50 - 1:200
        1:50
        抗體應(yīng)用
        WB, IP, IHC, IF, FCM, ChIP
        反應(yīng)性
        Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey
        抗體類型
        Rabbit Monoclonal Antibody
        儲(chǔ)存液配方
        PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN?
        儲(chǔ)存條件(自收到貨起)
        –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
        預(yù)測(cè)分子量
        65-78 kDa
        陽(yáng)性對(duì)照 human non-Hodgkin lymphoma; human endometrioid adenocarcinoma; human breast adenocarcinoma; human ovarian serous carcinoma; human non-small cell lung carcinoma; human colon carcinoma; human benign prostatic hyperplasia; mouse small intesine; mouse kidney; mouse cerebellum; Hela; A-204; SK-OV-3; MCF 10A; A549; MCF-7; 293T; PANC-1
        陰性對(duì)照 Hela (YAP KO); RL; BEN

        樣品處理數(shù)據(jù)示例

        樣品 處理情況
        HCT116 Low Expression
        RAW 264.7 Low Expression
        點(diǎn)擊查看更多樣品數(shù)據(jù)

        *該蛋白在不同的人源細(xì)胞、組織內(nèi)的表達(dá)量預(yù)測(cè)請(qǐng)參考:http://www.proteinatlas.org

        實(shí)驗(yàn)方法

        WB
        實(shí)驗(yàn)步驟:
         
        樣品制備
        1. 組織樣品:破碎組織,加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),低溫勻漿或置于冰上超聲裂解樣品,靜置30 min。
        2. 貼壁細(xì)胞樣品:吸去培養(yǎng)基, 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),超聲破碎,冰上靜置裂解 30 min。冰上靜置裂解 5 min。
        3. 懸浮細(xì)胞樣品:將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心,棄上清,用冰冷的 PBS 清洗細(xì)胞 2 遍。加入適量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer (含蛋白酶抑制劑Cocktail),冰上靜置裂解 5 min。
        4. 將所得勻漿液/裂解液置于離心機(jī)中 4°C 離心 15 min,收集上清液;
        5. 取少量裂解液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;
        6. 加入蛋白上樣緩沖液,將 20 µL樣品在 95~100°C加熱 5 min,冰上靜置冷卻后離心 5 min。
         
        電泳分離
        1. 根據(jù)所提蛋白的濃度,將適量蛋白樣品和 Marker 上樣至 SDS-PAGE 凝膠。建議分離膠(即下層膠)濃度:10 %。 SDS-PAGE 分離膠濃度選擇參照表
        2. 電源調(diào) 80 V, 30 min。然后電源調(diào) 110 V~150 V,觀察 Marker,待蛋白所在的預(yù)染蛋白 Marker 指示帶得到合適的分離后,即可停止電泳。(注意電泳時(shí)電流切勿過(guò)大,如超過(guò) 150 mA 會(huì)導(dǎo)致溫度上升,容易影響跑膠結(jié)果。如無(wú)法避免采用大電流,可對(duì)電泳槽使用冰浴降溫。)
         
        轉(zhuǎn)膜
        1.拿出電轉(zhuǎn)槽,把夾子和耗材浸泡在預(yù)冷電轉(zhuǎn)液中;
        2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min,用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗;
        3.按照“夾子黑邊-海綿-濾紙-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-濾紙-海綿-夾子白邊”的順序安裝好;
        4.將蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。(推薦采用 0.45 µm PVDF 膜) PVDF 膜孔徑規(guī)格選擇參照表
        濕轉(zhuǎn)法參考條件:200 mA, 120 min
        (注意電轉(zhuǎn)條件可根據(jù)蛋白大小適當(dāng)調(diào)節(jié),分子量大的蛋白適宜采用大電流,并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間,但需要確保電轉(zhuǎn)槽始終處于低溫的環(huán)境中,避免凝膠融化。)
         
        封閉
        1. 電轉(zhuǎn)移后,室溫下用 TBST 洗膜 5 min;
        2. 在封閉液中將膜孵育 1 h,室溫;
        3. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
         
        抗體孵育
        1. 用 一抗稀釋液配制一抗工作液(建議一抗稀釋比 1:1000),4°C 條件下與膜輕柔搖晃孵育過(guò)夜;
        2. 用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min;
        3. 在封閉液中加入二抗,室溫條件下與膜輕柔搖晃孵育 1 h;
        4. 孵育結(jié)束后,用 TBST 洗膜 3 次,每次 5 min。
         
        顯色
        1. 加入配制好的 ECL 發(fā)光底物(或根據(jù)二抗選擇其他顯色基質(zhì))混合均勻;
        2. 與膜孵育1 min,去除多余底物(需保持膜濕潤(rùn)),置于顯影儀中進(jìn)行曝光。
         
        IF
        實(shí)驗(yàn)步驟:
        樣品準(zhǔn)備
        1. 貼壁細(xì)胞:取潔凈無(wú)菌蓋玻片置于培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片。
        2. 懸浮細(xì)胞:將細(xì)胞接種至多聚賴氨酸包被的潔凈無(wú)菌載玻片上。
        3. 冰凍切片:將玻片置于室溫下解凍,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。
        4. 石蠟切片:先將玻片脫蠟至水,純水或 PBS 搖洗 3次,每次 3 min。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。
         
        固定
        1. 使用固定液,如4%多聚甲醛(4% PFA)室溫固定細(xì)胞爬片/涂片或組織切片 10~15 min。
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        通透
        1. 對(duì)樣品添加去垢劑,如 0.1~0.3% Triton X-100,室溫通透 10~20 min。
        (僅針對(duì)胞內(nèi)抗原,若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則可省略該步驟。)
        2. 使用 PBS 搖洗樣品 3次,每次 3 min。
         
        封閉
        添加封閉液,在室溫下封閉至少 1 h。(常用的封閉液包括:與二抗同一來(lái)源的血清、BSA或山羊血清。)
        注意事項(xiàng):從封閉開始之后的所有步驟務(wù)必保證樣品濕潤(rùn),避免干燥,否則極易產(chǎn)生高背景。
         
        免疫熒光染色(第一天)
        1. 吸走封閉液,滴加稀釋后的一抗。
        2. 濕盒中 4°C 孵育過(guò)夜。
         
        免疫熒光染色(第二天)
        1. 吸走一抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        2. 滴加稀釋后的熒光二抗,避光 4°C 孵育 1~2 h。
        3. 吸走二抗,PBST 搖洗 3 次,每次 5 min。
        4. 滴加稀釋后的 DAPI,室溫避光 孵育 5~10 min。
        5. PBST 中搖洗 3 次,每次 5 分鐘。
         
        封片
        1. 抗熒光淬滅封片劑封片。
        2. 干燥玻片,將玻片置于室溫下避光過(guò)夜。
        3. 將載玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
        IHC

        實(shí)驗(yàn)步驟:

         
        脫蠟/補(bǔ)液
        1. 脫蠟/水合切片:
        2. 將切片在二甲苯中孵育 3 次,每次 5 分鐘。
        3. 將切片在 100% 乙醇中孵育兩次,每次 10 分鐘。
        4. 將切片在 95% 乙醇洗滌液中孵育兩次,每次 10 分鐘。
        5. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        6.抗原修復(fù):對(duì)于檸檬酸鹽:將載玻片浸入 1X 檸檬酸鹽暴露溶液中,在微波爐中加熱,直至開始沸騰; 在亞沸溫度 (95°-98°C) 下繼續(xù)煮 10 分鐘。 在工作臺(tái)上冷卻玻片 30 分鐘。
         
        染色
        1. 用 dH2O 清洗切片 3 次,每次 5 分鐘。
        2. 將切片在 3% 過(guò)氧化氫中孵育 10 分鐘。
        3. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        4. 在洗滌緩沖液中洗滌切片 5 分鐘。
        5. 用 100–400 µl 封閉液在室溫下封閉每個(gè)切片 1 小時(shí)。
        6. 除去封閉液,并向每個(gè)切片中添加 100–400 µl 一抗稀釋液。 4°C 孵育過(guò)夜。
        7. 去除抗體溶液,用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次,每次 5 分鐘。
        8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆蓋切片。 在加濕室中室溫孵育 30 分鐘。
        9. 用洗滌緩沖液洗滌切片 3 次,每次 5 分鐘。
        10. 使用前將 DAB 顯色劑濃縮液加入 DAB 稀釋液中并充分混合。
        11. 在每個(gè)切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切監(jiān)測(cè)。 1-10 分鐘通常可提供可接受的染色強(qiáng)度。
        12. 將載玻片浸入 dH2O 中。
        13. 如果需要,用蘇木精復(fù)染切片。
        14. 用 dH2O 清洗切片兩次,每次 5 分鐘。
        15. 切片脫水:95%乙醇孵育切片兩次,每次 10 秒; 在 100% 乙醇中重復(fù),孵育切片兩次,每次 10 秒; 在二甲苯中重復(fù),孵育切片兩次,每次 10 秒。
        16. 用蓋玻片和封固劑封固切片。

        Datasheet & SDS

        生物描述

        特異性

        YAP Antibody [C6K11] 可檢測(cè)內(nèi)源性總 YAP 的蛋白水平。

        蛋白定位
        細(xì)胞連接,細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核
        Uniprot ID
        P46937
        克隆號(hào)
        C6K11
        別名
        YAP,YAP1
        背景

        Yes 相關(guān)蛋白 (YAP 或 YAP1) 是一種由位于人類 11q22 染色體上的 YAP 基因編碼的癌蛋白。它是 Hippo 信號(hào)通路中的關(guān)鍵下游效應(yīng)子,與轉(zhuǎn)錄輔激活因子 TAZ(具有 PDZ 結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔激活因子)協(xié)同作用。YAP 和 TAZ 在調(diào)控細(xì)胞增殖、再生、器官發(fā)育和干細(xì)胞自我更新方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其活性受細(xì)胞外信號(hào)和細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控。YAP 還通過(guò)激活生存途徑(如 survivin/桿狀病毒 IAP 重復(fù)序列 5)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)細(xì)胞存活。YAP 包含 488 個(gè)氨基酸,包括幾個(gè)結(jié)構(gòu)域,特別是 TEA DNA 結(jié)合域和兩個(gè) WW 域。它的調(diào)控主要受 Hippo 信號(hào)通路控制。YAP/TAZ 復(fù)合物的抑制因子,大型腫瘤抑制因子 1 和 2 (LATS1 和 LATS2) 磷酸化 YAP,將其隔離在細(xì)胞質(zhì)中并抑制其活性。YAP 的關(guān)鍵調(diào)控因子之一是 G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR),它包含三個(gè)亞基:α、β 和 γ。特定的 GPCR 亞型,包括 Gα11、Gα12、Gα13、Gαi、Gαo 和 Gαq,可激活 YAP 和 TAZ,而 Gαs 可抑制它們。GPCR 激活 YAP 是通過(guò) Rho GTPase 誘導(dǎo)的 F-肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的。LATS 激酶在特定位點(diǎn)(例如 Ser109 和 Ser127)進(jìn)行磷酸化,導(dǎo)致 YAP 從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì),在那里它與 14-3-3 蛋白相互作用。這些 LATS 介導(dǎo)的磷酸化事件也為 YAP 在相鄰的磷酸化位點(diǎn)被 CK1δ/ε 進(jìn)一步磷酸化做好準(zhǔn)備,從而導(dǎo)致 YAP 的蛋白酶體降解。

        參考文獻(xiàn)
        • https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27698789/

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