Mouse CD11b Cell lsolation Kit

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

緩沖液配制： PBS緩沖液（pH 7.2）包括0.5%的BSA和2 mM EDTA，需預(yù)先通過0.22 μm濾膜過濾除菌。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：
用1mL的注射器吸取適量的1×PBS，從骨腔兩端反復(fù)沖洗骨腔，直到將其中的骨髓完全洗出，收集細(xì)胞懸液于50ml離心管中，300 g，離心3 min。
離心完成后，棄上清，加入10 ml ACK紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解10 min，再加入10 mL PBS，300 g，離心3 min。
離心完成后，棄上清，將骨髓細(xì)胞重懸于PBS，計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后，繼續(xù)以300 g，離心3 min。
離心完成后，棄上清，將細(xì)胞重懸于分選buffer中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁸ cells/mL。
2. CD11b微珠標(biāo)記：每10⁷細(xì)胞中加入 10 µL CD11b微珠，混勻后 4 ℃孵育15 min，每隔5 min輕彈混勻，避免細(xì)胞聚集。
注意： 分選更多細(xì)胞時，按比例增加CD11b微珠用量（如分選5×10⁷細(xì)胞，需在500 μL細(xì)胞懸液中加入50 μL CD11b微珠）。
3. 洗滌細(xì)胞：孵育完成后，加入1 mL分選buffer（避免劇烈振蕩或上下顛倒混勻）。300 g離心3 min，棄上清，加入1 mL分選buffer重懸細(xì)胞。
4. 磁珠分選：
將分選柱置于MACS分離器的磁場中，用緩沖液沖洗分選柱（MS柱： 500 μL；LS柱： 2 mL）。
將細(xì)胞懸液加入分選柱，收集未標(biāo)記的流經(jīng)細(xì)胞（可選），再用分選液清洗分選柱（MS柱： 2×1 mL；LS柱： 2×3 mL）。
5. 收集CD11b陽性細(xì)胞：移出分選柱，加入適量緩沖液，用柱塞快速沖洗，收集磁性標(biāo)記的CD11b陽性細(xì)胞（MS柱： 2×1 mL；LS柱： 2×3 mL）。
注意： 每次液體完全流盡后再進(jìn)行下一步操作。
6. （可選）二次富集： 若需更高純度，可重復(fù)步驟4-5，在第二個分選柱上再次富集CD11b陽性細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)全程保持低溫（4℃），動作迅速以減少細(xì)胞損傷。