Mouse NK Cell Negative Selection Kit

 

1. 樣本準(zhǔn)備:
a. 制備單細(xì)胞懸液：在 70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的 PBS 沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于 50 ml 離心管中，500 g，離心 5 min。
b. 離心完成后，棄上清，加入5 ml ACK 紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解 5 min，再加入 20 ml PBS，500 g，離心 5 min。
注意：紅細(xì)胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液不同調(diào)整用量及時(shí)間。少量紅細(xì)胞殘留不會(huì)影響后續(xù)分選及細(xì)胞純度。
c. 離心完成后，棄上清，將脾細(xì)胞重懸于 PBS，細(xì)胞懸液用 70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后，繼續(xù)以 500 g，離心 5 min。
d. 離心完成后，棄上清，將細(xì)胞重懸于分選 buffer 中，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×10⁸ cells/ml。
2. 將 100 μl 細(xì)胞懸液（1×10⁷ 個(gè)細(xì)胞）加入無菌流式管底部，再加入2 μl Biotin-Ab Mix，混勻后 4℃ 孵育 10 min。
注意：加入細(xì)胞懸液時(shí)將細(xì)胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據(jù)所使用磁力架特點(diǎn)也可使用離心管進(jìn)行細(xì)胞分選。如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加 Biotin-Ab Mix 用量。
3. 孵育完成后，在流式管中加入 20 μl 鏈霉親和素磁珠（使用前渦旋振蕩重懸磁珠），混勻后 4℃ 孵育 10 min。孵育過程中應(yīng)輕輕敲打管壁 1~2 次，防止細(xì)胞和磁珠沉降。
注意：如果分選更多細(xì)胞，則按比例增加鏈霉親和素磁珠用量。例如分選 5×10⁷ 細(xì)胞，則應(yīng)在 500 μl 細(xì)胞懸液中加入 10 μl Biotin-Ab Mix 和 100 μl 鏈霉親和素磁珠。如果分選少于 1×10⁷ 個(gè)細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液體積補(bǔ)至 100 μl，使用 2 μl Biotin-Ab Mix 和 20 μl 鏈霉親和素磁珠。
4. 孵育完成后，在流式管加入 2.5 ml 分選 buffer，以移液器上下混合吹打 5 次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。
5. 將含有細(xì)胞的分選流式管置于磁力架上（若沒有合適的磁力架，可將流式管中液體轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中再置于磁力架上），靜置5 min。
6. 將細(xì)胞懸液倒入無菌離心管中（傾倒過程中流式管不要脫離磁力架）或用吸管吸入離心管中（勿將液體吸盡，防止吸到磁珠），500 g，離心5 min。細(xì)胞懸液中即包含純化的小鼠 NK 細(xì)胞，離心后棄上清，收集細(xì)胞。
7. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于所需緩沖液或培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)分子生物學(xué)或細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。