鼠尾直接PCR試劑盒(快速基因型鑒定)

僅限科研使用

鼠尾直接PCR試劑盒專為小鼠快速基因型鑒定（快速基因型鑒定）而研制。試劑盒中包含的高效組織消化液（Buffer L, Protease Plus）能夠迅速從小鼠尾巴、耳朵或腳趾等組織中釋放足量的基因組DNA，消化時間僅需15分鐘，無需抽提與純化，可直接將消化產(chǎn)物作為模板加入抗干擾型2 x M-PCR Mix中進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物可直接點樣進行電泳觀察。

產(chǎn)品優(yōu)勢

操作簡單：無需DNA提取，裂解液直接PCR鑒定；

省時：比傳統(tǒng)方法節(jié)約13h（以基因組DNA為例）。

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價格對比

產(chǎn)品描述

本試劑盒專為小鼠快速基因型鑒定（Genotyping）而研制。試劑盒中包含的高效組織消化液（Buffer L, Protease Plus）能夠迅速從小鼠尾巴、耳朵或腳趾等組織中釋放足量的基因組DNA，消化時間僅需15分鐘，無需抽提與純化，可直接將消化產(chǎn)物作為模板加入抗干擾型2 x M-PCR Mix中進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物可直接點樣進行電泳觀察。實驗操作簡便而省時。

應(yīng)用范圍

小鼠基因型鑒定（尾巴、耳朵或腳趾）

小鼠基因組DNA擴增、測序

結(jié)果分析：

Mouse Direct PCR Kit對鼠尾、鼠趾、鼠耳都適用，55℃消化15min和30min的效果無顯著性差異，對于大片段3Kb也能有效擴增。
注：其中片段500bp和3Kb左右的引物是根據(jù)小鼠GAPDH基因設(shè)計的；片段1Kb和2Kb的引物是根據(jù)小鼠Ppip5k2基因設(shè)計的。

產(chǎn)品組成

Complete Kit	B40013 (200 rxns)	B40015 (500 rxns)
Buffer L (mL)	20	50
Protease Plus (mL)	0.4	1
2 x M-PCR OPT Mix (mL)	2	5
User Guide	Yes	Yes

儲存條件(自收到貨起)

Buffer L 4℃保存，其余組分-20℃保存。保質(zhì)期2年。

實驗方法

1. 組織消化

1.1. 按小鼠數(shù)量配制組織消化液，試劑比例如下：

	單樣本
Protease Plus	2 μL
Buffer L	100 μL

組織消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，充分混勻后使用。

1.2. 向每個含有樣本的EP管中加入100 μL新鮮組織消化液，55℃水浴/金屬浴中消化15 min。組織消化時，務(wù)必將組織完全浸沒于消化液中。消化完成后，組織外觀上仍然完整，但足量的基因組DNA已經(jīng)釋放，不影響后續(xù)的PCR實驗。

1.3. 將樣本置于95℃水浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清或連同組織的消化液可于-20℃保存三個月。

2. PCR擴增

2.1. PCR反應(yīng)體系：

反應(yīng)體系的配制最好于低溫環(huán)境下（如冰浴）完成，以保證PCR擴增效率和擴增特異性。

PCR 反應(yīng)組分	20 μL 反應(yīng)體系 (μL)	50 μL 反應(yīng)體系 (μL)
ddH₂O	8	21
正向引物 (10 μM)	0.5	1
反向引物 (10 μM)	0.5	1
模板（消化產(chǎn)物）	1	2
2 x M-PCR OPTI Mix	10	25

注：模板體積可以適當調(diào)整。

2.2. PCR反應(yīng)條件：

溫度 (℃)	時間	循環(huán)數(shù)
94	5 min	1
94	20 sec	35
50-65	30 sec
72	X min (2 kb /min)
72	5 min	1
12	--	1

PCR產(chǎn)物的3’端帶有堿基A，可直接克隆至T載體，用于DNA測序。

3. 瓊脂糖凝膠電泳

試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍染料，PCR產(chǎn)物可直接點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。

常見問題及解決方法

常見問題	可能原因	對策
樣本組與陽性對照組均無擴增條帶	長期存儲或存儲條件不當導(dǎo)致試劑失活	使用新的試劑盒
	引物質(zhì)量問題	重新設(shè)計合成引物
	退火溫度過高	建議每2℃為一個梯度降低退火溫度，摸索最佳條件
	延伸時間過短或循環(huán)數(shù)過少	適當增長延伸時間或提高循環(huán)數(shù)至36-40 Cycles
樣本組無擴增條帶而陽性對照組正常	未充分消化組織樣本	將消化時間延長至30 min
	加入過多模板抑制PCR	降低模板用量
	未完全滅活蛋白酶活性	消化產(chǎn)物在95℃加熱5 min
有非特異性擴增條帶	PCR引物錯配	重新設(shè)計PCR引物
	PCR體系配制不當（引物濃度或DNA模板濃度過高）	適當降低引物和模板用量
	PCR反應(yīng)條件設(shè)置不當（退火溫度過低或循環(huán)數(shù)過高）	適當提高退火溫度或降低循環(huán)數(shù)
	配制PCR體系時環(huán)境溫度過高或體系配制完成到PCR儀反應(yīng)間隔時間過久	在冰浴環(huán)境下配制PCR反應(yīng)體系，完成后盡快放入PCR儀中開始反應(yīng)
陰性對照出現(xiàn)目的條帶	PCR試劑或操作工具污染	使用新的試劑，重新高壓滅菌ddH₂O和PCR用品。操作過程中動作盡量輕柔，避免加樣濺出污染其他樣品
實驗結(jié)果重復(fù)性不好	試劑活性不穩(wěn)定或DNA模板降解	低溫保存所有試劑，重新提取樣本基因組DNA
	樣本DNA交叉污染	建議每個取樣器只取一個樣本，或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸沒在75%酒精或2%次氯酸鈉溶液中反復(fù)涮洗，用干凈的紙巾擦干后，再取下一個樣本
	PCR產(chǎn)物交叉污染	操作過程中動作盡量輕柔，避免管中PCR產(chǎn)物濺出污染其他樣品。電泳上樣過程中，小心加入適量PCR產(chǎn)物到相應(yīng)泳道中，避免上樣過多溢出或動作過大而污染相鄰泳道樣品。注意勤換槍頭以避免產(chǎn)物交叉污染

技術(shù)支持

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